大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)問題及對(duì)策(編輯修改稿)
2024-07-04 17:37 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 表明, 細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率降低時(shí), 產(chǎn)物的比生長(zhǎng)速率提高，有人控制細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率為最大比生長(zhǎng)速率的60%抗體生長(zhǎng)速率增加了97%。 灌注培養(yǎng)可以從兩個(gè)方面入手, 一是改變動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境, 實(shí)行階段培養(yǎng)。 二是進(jìn)行代謝調(diào)控。2. 1 階段培養(yǎng)一般認(rèn)為, 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件應(yīng)盡量模擬來源動(dòng)物體內(nèi)的條件, 而且在培養(yǎng)中通常保持不變。而實(shí)際上, 每種細(xì)胞的最適生長(zhǎng)條件和最適產(chǎn)物生成條件是不同的。階段法培養(yǎng)就是根據(jù)這一點(diǎn), 把培養(yǎng)過程分為細(xì)胞生長(zhǎng)期和產(chǎn)物生成期, 分別采取不同的培養(yǎng)條件, 以達(dá)到在細(xì)胞生長(zhǎng)期使接種細(xì)胞大量繁殖, 提高比生長(zhǎng)速率, 盡快獲得高密度細(xì)胞。 在產(chǎn)物生成期保持細(xì)的高密度, 維持存活率, 降低細(xì)胞死亡速率, 持續(xù)獲得高產(chǎn)率蛋白的目的。當(dāng)產(chǎn)物蛋白對(duì)細(xì)胞有抑制時(shí), 階段培養(yǎng)尤見優(yōu)勢(shì)。具體說來, 可以用以下方法。2. 1 階段培養(yǎng)一般認(rèn)為, 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件應(yīng)盡量模擬來源動(dòng)物體內(nèi)的條件, 而且在培養(yǎng)中通常保持不變。而實(shí)際上, 每種細(xì)胞的最適生長(zhǎng)條件和最適產(chǎn)物生成條件是不同的。階段法培養(yǎng)就是根據(jù)這一點(diǎn), 把培養(yǎng)過程分為細(xì)胞生長(zhǎng)期和產(chǎn)物生成期, 分別采取不同的培養(yǎng)條件, 以達(dá)到在細(xì)胞生長(zhǎng)期使接種細(xì)胞大量繁殖, 提高比生長(zhǎng)速率, 盡快獲得高密度細(xì)胞。 在產(chǎn)物生成期保持細(xì)的高密度, 維持存活率, 降低細(xì)胞死亡速率, 持續(xù)獲得高產(chǎn)率蛋白的目的。當(dāng)產(chǎn)物蛋白對(duì)細(xì)胞有抑制時(shí), 階段培養(yǎng)尤見優(yōu)勢(shì)。具體說來, 可以用以下方法。2. 1. 2 pH 值階段培養(yǎng)對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞, 培養(yǎng)液中合適的pH為7. 2—7. 4。低于6. 8 或高于7. 6 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)都不利。近年來, 對(duì)胞內(nèi)pH 的研究比較活躍。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) 胞內(nèi)pH 對(duì)細(xì)胞的代謝影響很大, 胞內(nèi)pH 降低0. 2 個(gè)單位, 就足以使磷酸果糖激酶失活, 抑制糖酵解途徑, 使細(xì)胞的生長(zhǎng)受阻。 而胞內(nèi)pH 升高0. 2 個(gè)單位,可以提高糖酵解速度50%。胞外pH 的降低和培養(yǎng)液中銨離子濃度的提高, 都能引起胞漿酸化, 胞內(nèi)pH 降低。有人把CO 2 的濃度由5% 降為2. 5% ,胞內(nèi)pH 提高了0. 2 個(gè)單位。胞內(nèi)pH 比胞外pH 的檢測(cè)麻煩 , 所以還沒有廣泛應(yīng)用。2. 1. 3 溶氧階段培養(yǎng) 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的最適溶氧值為60% , 但有人發(fā)現(xiàn)雜交瘤的最適溶氧為100%。一般說來, 溶氧主要影響細(xì)胞的繁殖, 而對(duì)產(chǎn)物的生成無直接影響, 通過影響細(xì)胞生長(zhǎng)間接起作用。通常在細(xì)胞生長(zhǎng)初期控制溶氧的較低的水平, 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到較高的濃度時(shí), 提高溶氧水平。 在產(chǎn)物生成期, 應(yīng)控制溶氧的適當(dāng)水平。溶氧過高, 細(xì)胞就會(huì)加速消耗營養(yǎng)物質(zhì), 產(chǎn)生許多代謝產(chǎn)物。這些代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有抑制作用, 會(huì)大大降低細(xì)胞的存活率, 降低產(chǎn)物的比生成速率。溶氧過低, 細(xì)胞過氧的需求得不到滿足, 依然會(huì)降低產(chǎn)物蛋白的產(chǎn)率。2. 1. 4 化學(xué)試劑誘導(dǎo)階段培養(yǎng)如果構(gòu)建的細(xì)胞上有可誘導(dǎo)基因, 進(jìn)入產(chǎn)物生成期后, 就可以添加化學(xué)試劑對(duì)基因進(jìn)行誘導(dǎo), 以實(shí)現(xiàn)目的基因的高表達(dá), 比如,將表達(dá)尿激酶原和二氫葉酸還原酶基因的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位置于同一載體, 分別受金屬硫(M T ) 和SV 40 早期啟動(dòng)子控制, 具有用氨甲喋呤(M TX) 使基因擴(kuò)增和利用金屬Zn2+ 誘導(dǎo)的雙重功能, 有利于尿激酶的高表達(dá)。細(xì)胞在細(xì)胞周期的不同時(shí)期, 不僅蛋白的分泌速率不同, 而且所分泌蛋白的類型和糖基化程度也可能不同。因此, 研究并控制細(xì)胞的生理狀態(tài)很重要。然而, 在細(xì)胞培養(yǎng)中, 細(xì)胞生理狀態(tài)的檢測(cè)很麻煩。有人發(fā)現(xiàn),細(xì)胞大小隨各時(shí)期變化很明顯, 因此可以作電子細(xì)胞計(jì)數(shù)器就行了。分段培養(yǎng)應(yīng)結(jié)合具體的培養(yǎng)條件進(jìn)行。有些細(xì)胞的最適生長(zhǎng)溫度和產(chǎn)物生成溫度相同, 就不能進(jìn)行溫度階段培養(yǎng), 而應(yīng)尋找別的差異條件。在細(xì)胞生長(zhǎng)期有的細(xì)胞可能會(huì)因比生長(zhǎng)速率過大而產(chǎn)生非生產(chǎn)性細(xì)胞, 這時(shí)就應(yīng)控制比生長(zhǎng)速率在一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶? 代謝調(diào)控培養(yǎng)乳酸和氨是在培養(yǎng)過程中動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物 , 對(duì)細(xì)胞的正常生理功能在抑制甚至毒害作用。在分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的這一問題尤為突出。盡管灌注培養(yǎng)可以通過提高灌注速度來去除抑制產(chǎn)物。但是, 一方面由于灌注培養(yǎng)細(xì)胞濃度很高, 提高灌注速率, 營養(yǎng)成分的供給十分充分, 氨和乳酸的產(chǎn)生速率也增加了。另一方面, 過高的灌注速率提高了細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率, 降低產(chǎn)物的比產(chǎn)率, 加上細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)的利用并不徹底, 培養(yǎng)液中會(huì)殘留大量的蛋白, 造成提取純化的不便和培養(yǎng)基的浪費(fèi)。所以, 在培養(yǎng)中調(diào)控動(dòng)物細(xì)胞的代謝途徑一直較受重視。通過代謝調(diào)控, 可以減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生, 降低細(xì)胞的死亡速率, 還可以控制灌注速率和培養(yǎng)液成分, 控制細(xì)胞的狀態(tài)和比生長(zhǎng)速率, 以提高目標(biāo)蛋白的產(chǎn)率。具體有以下方法。3. 1 控制葡萄糖濃度法乳酸濃度升高,會(huì)導(dǎo)致比生長(zhǎng)速率降低, 比死亡速率升高。乳酸的降低可更換葡萄糖為己糖如果糖或半乳糖 , 還可限制葡萄糖減少乳酸的生成, 使初始葡萄糖濃度較低, 在培養(yǎng)過程中再添加。在控制葡萄糖濃度法培養(yǎng)中, 生長(zhǎng)期可以使葡萄糖濃度稍高, 以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。 在產(chǎn)物合成期降低葡萄糖的濃度, 降低乳酸的產(chǎn)生速率, 避免乳酸的積累, 減少毒害, 降低死亡速率, 維護(hù)持活細(xì)胞數(shù)在較高水平。同時(shí)還可以降低比生長(zhǎng)速率, 增加目標(biāo)蛋白的產(chǎn)生速率。灌注葡萄糖的同時(shí), 要間歇或連續(xù)地加入其他組分, 以避免營養(yǎng)缺乏, 其中谷氨酰胺要保持在較低水平, 因?yàn)榧?xì)胞的生長(zhǎng)不依賴糖酵解 , 即使沒有葡萄糖, 細(xì)胞仍可以通過降解谷氨酰胺獲得能量。假如谷氨酰胺的濃度過高, 細(xì)胞就會(huì)偏向谷氨酰胺酵解, 從而削弱這種方法的效果。由于葡萄糖的價(jià)格相對(duì)低廉, 這種方法很有前途。3. 2 控制谷氨酰胺法上面提到, 沒有葡萄糖, 細(xì)胞可以利用谷氨酰胺作能量物質(zhì)。因此, 控制谷氨酰胺比控制葡萄糖要容易些, 應(yīng)用這一方法的報(bào)道也較多。控制谷氨酰胺濃度的目的, 主要是減少氨的產(chǎn)生。氨對(duì)細(xì)胞的毒性比乳酸大得多, 表現(xiàn)為降低比生長(zhǎng)速率, 增加死亡速率。有人詳細(xì)地研究了動(dòng)物細(xì)胞的代謝過程, 采用底物限制補(bǔ)料分批工藝對(duì)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行代謝控制。他采用這一方法, 使氨的濃度降低了一半?？刂乒劝滨０贩ㄅc控制葡萄糖法一樣, 要維持葡萄糖在較低水平。3. 3 控制葡萄糖和谷氨酰胺法在細(xì)胞中, 葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝密切相關(guān)。葡萄糖消耗上升, 則谷氨酰胺消耗下降, 反之亦然。在相當(dāng)大的一個(gè)范圍內(nèi), 葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率與其濃度成正比
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