【正文】 減少而分泌增加。但無(wú)血清培養(yǎng)基并不適用于廣泛的細(xì) 胞類型，不同類型的細(xì)胞甚至不同的細(xì)胞系或細(xì)胞株都有可能有各自的無(wú)血清培養(yǎng)基構(gòu)成。在大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，細(xì)胞凋亡/死亡多是在營(yíng)養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多時(shí)發(fā)生。對(duì)于有些細(xì)胞株 盡管能貼在微載體內(nèi)，但“移動(dòng)性”很差，因此需要發(fā)明一種更好的培養(yǎng)方式，提高微孔的開(kāi)放性或者改善其表面特性，從而提高細(xì)胞貼壁率同時(shí)增加細(xì)胞移動(dòng)性。不管用NaCl、KCl還是蔗糖升高滲透壓，均可增加批次培養(yǎng)中抗體濃度。MG能改變氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸的氨基 和巰基。CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器中，最適CO2水平為4%～10％。LDH受抑制后阻止了NADH向NAD的再生及其偶聯(lián)的丙酮酸/乳酸轉(zhuǎn) 換，從而導(dǎo)致NADH增加。氨的積聚使細(xì)胞內(nèi)UDP氨基己 糖(UDPN乙酰葡糖胺和UDPN乙酰半乳糖胺)增加，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)及蛋白的糖基化過(guò)程。目前，世界眾多研究領(lǐng)域集中在優(yōu)化細(xì) 胞培養(yǎng)環(huán)境、改變細(xì)胞特性、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率并保證其質(zhì)量和一致性上。但兩者都涉及谷氨酰胺，因此需 要防止培養(yǎng)基中Gln自然分解，限制Gln用量，并盡量去除培養(yǎng)基中的氨。由于Gln和葡萄糖代謝的相互影響，因此降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度以減少乳酸產(chǎn)生的同時(shí)，必須平衡葡萄糖和Gln的比例。這表明CHO細(xì)胞生產(chǎn)tPA具有很強(qiáng)糖基化能力。然而，MG濃度降低的細(xì)胞與在典型生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件下的細(xì)胞的生長(zhǎng)活力有何不同尚未確定。另外，在培養(yǎng)基中加入諸如甘氨酸甜菜堿、三甲基甘氨酸或脯氨酸等滲透壓保護(hù)劑在一定程度上減輕了高滲透壓對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，但不影響細(xì)胞表達(dá)目的蛋白質(zhì)的水平，同時(shí)可使細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間的維持高水平表達(dá)。bcl2基因的過(guò)量表達(dá)能抑制Gln或氧缺乏引起的細(xì)胞凋亡， 減少細(xì)胞特定營(yíng)養(yǎng)成分的消耗，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)量,這對(duì)于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)具有重大意義。在經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無(wú)血清培養(yǎng)基成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域研究的一大課題。通過(guò)細(xì)胞工程方法使細(xì)胞高水平表達(dá)外源基因并正確加工表達(dá)產(chǎn)物，從而提高整個(gè)表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)率，也成為應(yīng)用大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)外源目的蛋白的研究的重 要手段。但是，SV40早期啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子調(diào) 控基因表達(dá)均發(fā)生在S期，CHO細(xì)胞中腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AMLP)調(diào)控外源基因表達(dá)是在G1期。最近幾年中有關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程監(jiān)控的研究迅速增多。細(xì)胞培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)需要的重點(diǎn) 將繼續(xù)朝著維持或增加產(chǎn)品質(zhì)量及一致性上努力。直到六十年代, 灌注培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn), 為動(dòng)物細(xì)胞高密度大規(guī)模培養(yǎng)開(kāi)辟了廣闊的前景。2　灌注培養(yǎng)方法在灌注培養(yǎng)前, 對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)和生理特性進(jìn)行充分的考察, 是十分必要的, 能為灌注培養(yǎng)提供有益的參考。當(dāng)產(chǎn)物蛋白對(duì)細(xì)胞有抑制時(shí), 階段培養(yǎng)尤見(jiàn)優(yōu)勢(shì)。2. 1. 2　pH 值階段培養(yǎng)對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞, 培養(yǎng)液中合適的pH為7. 2—7. 4。2. 1. 3　溶氧階段培養(yǎng) 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的最適溶氧值為60% , 但有人發(fā)現(xiàn)雜交瘤的最適溶氧為100%。細(xì)胞在細(xì)胞周期的不同時(shí)期, 不僅蛋白的分泌速率不同, 而且所分泌蛋白的類型和糖基化程度也可能不同。在分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的這一問(wèn)題尤為突出。乳酸的降低可更換葡萄糖為己糖如果糖或半乳糖 , 還可限制葡萄糖減少乳酸的生成, 使初始葡萄糖濃度較低, 在培養(yǎng)過(guò)程中再添加。因此, 控制谷氨酰胺比控制葡萄糖要容易些, 應(yīng)用這一方法的報(bào)道也較多。在相當(dāng)大的一個(gè)范圍內(nèi), 葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率與其濃度成正比。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和產(chǎn)品分離技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展, 建立細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離的耦合系統(tǒng)(圖2) , 能充分利用培養(yǎng)液, 降低生產(chǎn)成本, 一直是人們追求的目標(biāo), 這里就不贅述。亦可用各種活化偶聯(lián)介質(zhì)偶聯(lián)目標(biāo)蛋白的底物、受體等自制親和介質(zhì)，再用以結(jié)合目標(biāo)蛋白。將離心、超濾、初純化結(jié)合為一。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質(zhì)，專為俘獲整個(gè)細(xì)胞或大復(fù)合物，如膜囊等。血清互補(bǔ)劑如小牛血清可先用蛋白G預(yù)處理，在培養(yǎng)前除去IgG。重組蛋白在設(shè)計(jì)、構(gòu)建時(shí)應(yīng)已融入純化構(gòu)想。高化學(xué)穩(wěn)定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝膠過(guò)濾介質(zhì)很適合在變性條件下做純化。固相復(fù)性避免了一般復(fù)性過(guò)程中蛋白質(zhì)聚體的形成，所以復(fù)性得率更高，而且無(wú)需大量稀釋樣品，并將復(fù)性和初純化合二為一，大大節(jié)省時(shí)間及提高回收率。Sephadex LH20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用于各種天然產(chǎn)物的分離，包括生物堿、甙、黃酮、醌類、內(nèi)脂、萜類、甾類等。陰陽(yáng)離子交換法可以一、兩步快速去除多糖中殘存的蛋白質(zhì)。、病毒核酸的純化用于去除影響測(cè)序或PCR污染物等研究。只需在進(jìn)樣后收集首1/31/2柱體積的洗脫液，就可以去除該填料分離范圍上限以下的小分子，簡(jiǎn)單直接。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S500HR，如甲肝疫苗等。內(nèi)毒素與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強(qiáng)結(jié)合。核酸在高鹽下會(huì)和蛋白解離,疏水層析介質(zhì)很適合用來(lái)結(jié)合目標(biāo)蛋白,在純化蛋白的同時(shí)去除核酸?！《竞臀⑸锊《竞臀⑸锟沙蔀椴≡?應(yīng)盡量減除。利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶聯(lián)內(nèi)毒素底物如LAL，PMB，自動(dòng)成親合層析介質(zhì)結(jié)合內(nèi)毒素。SORRCE 15 Sepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl S500，Plasmidselect在下游純化中,可應(yīng)用不同層析技術(shù)在純化生物分子的同時(shí),去除各種污染物。整個(gè)過(guò)程一般可于數(shù)分鐘至半小時(shí)完成。病毒也可視作核酸大分子，和質(zhì)粒DNA一樣，可用分離大分子的Sephacry S1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過(guò)濾介質(zhì)去除雜蛋白，再配合離子交換如Mono Q、 SOURCE Q分離核酸。由于中藥的成分非常復(fù)雜，SOURCE反相層析可用范圍為PH114 ，并可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。相反，黃酮、蒽醌、皂甙、有機(jī)酸等可溶于偏堿的緩沖液中，在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。兩種親和層析預(yù)裝柱均可反復(fù)多次重復(fù)使用，比一般試劑盒更方便、耐用。Superdex 7Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分別被發(fā)現(xiàn)有助包涵體蛋白的復(fù)性。Amersham biosciences提供三個(gè)快速表達(dá)、一步純