大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)問(wèn)題及對(duì)策(參考版)
2025-06-10 17:37本頁(yè)面
【正文】 。再用適當(dāng)?shù)碾x子交換介質(zhì)如CM Sepharose FF結(jié)合目標(biāo)蛋白，去除S/D。病毒大都有脂外殼?！《竞臀⑸锊《竞臀⑸锟沙蔀椴≡?應(yīng)盡量減除。核酸在高鹽下會(huì)和蛋白解離,疏水層析介質(zhì)很適合用來(lái)結(jié)合目標(biāo)蛋白,在純化蛋白的同時(shí)去除核酸。胞內(nèi)表達(dá)蛋白的核酸問(wèn)題尤其嚴(yán)重。——蛋白中的核酸大量核酸增加樣本黏度，令區(qū)帶擴(kuò)張，反壓增加，降低分辨率和流速。利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶聯(lián)內(nèi)毒素底物如LAL，PMB，自動(dòng)成親合層析介質(zhì)結(jié)合內(nèi)毒素。內(nèi)毒素與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強(qiáng)結(jié)合。但在高鹽下會(huì)凝集，無(wú)法上疏水層析。含脂肪A、糖類和蛋白，是帶負(fù)電的復(fù)合大分子。SORRCE 15 Sepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl S500，Plasmidselect在下游純化中,可應(yīng)用不同層析技術(shù)在純化生物分子的同時(shí),去除各種污染物。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S500HR，如甲肝疫苗等。柱高一般4070cm，整個(gè)過(guò)程約半至一小時(shí)。HiPrep Desalting(26ml)可在數(shù)分鐘為多至10ml樣品脫鹽。整個(gè)過(guò)程一般可于數(shù)分鐘至半小時(shí)完成。只需在進(jìn)樣后收集首1/31/2柱體積的洗脫液，就可以去除該填料分離范圍上限以下的小分子，簡(jiǎn)單直接。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產(chǎn)物，并避免凝集和保護(hù)基的脫落。病毒也可視作核酸大分子，和質(zhì)粒DNA一樣，可用分離大分子的Sephacry S1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過(guò)濾介質(zhì)去除雜蛋白，再配合離子交換如Mono Q、 SOURCE Q分離核酸。、病毒核酸的純化用于去除影響測(cè)序或PCR污染物等研究。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設(shè)計(jì)的凝膠過(guò)濾預(yù)裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽類的來(lái)源有天然萃取，合成肽和重組肽三種。由于中藥的成分非常復(fù)雜，SOURCE反相層析可用范圍為PH114 ，并可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。陰陽(yáng)離子交換法可以一、兩步快速去除多糖中殘存的蛋白質(zhì)。綜合利用分子篩及離子交換層析有助進(jìn)一步獲各組份純品。若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可選擇新一代的Superdex。相反，黃酮、蒽醌、皂甙、有機(jī)酸等可溶于偏堿的緩沖液中，在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。Sephadex LH20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用于各種天然產(chǎn)物的分離，包括生物堿、甙、黃酮、醌類、內(nèi)脂、萜類、甾類等。如離子交換、分子篩、反相層析，更容易分離到單一活性成分。傳統(tǒng)中藥多是煎熬后服用，有效成份多較為親水，包括生物堿、黃酮、蒽醌、皂甙、有機(jī)酸、多糖、肽和蛋白質(zhì)。兩種親和層析預(yù)裝柱均可反復(fù)多次重復(fù)使用，比一般試劑盒更方便、耐用。固相復(fù)性避免了一般復(fù)性過(guò)程中蛋白質(zhì)聚體的形成，所以復(fù)性得率更高，而且無(wú)需大量稀釋樣品，并將復(fù)性和初純化合二為一，大大節(jié)省時(shí)間及提高回收率。*近年許多文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質(zhì)上，一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質(zhì)。SOURCE 30 RPC反相層析介質(zhì)很適合純化復(fù)性前的粗品，并可以1MnaOH重生。Superdex 7Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分別被發(fā)現(xiàn)有助包涵體蛋白的復(fù)性。高化學(xué)穩(wěn)定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝膠過(guò)濾介質(zhì)很適合在變性條件下做純化。HisTrap試劑盒提供整套HisTag蛋白的純化方法。2． 蛋白A融合載體使要表達(dá)的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以IgG Sepharose 6 FF純化。Amersham biosciences提供三個(gè)快速表達(dá)、一步純化的融合系統(tǒng)。重組蛋白在設(shè)計(jì)、構(gòu)建時(shí)應(yīng)已融入純化構(gòu)想。*HiTrap IgM是用來(lái)純化融合瘤細(xì)胞培養(yǎng)的單抗IgM，結(jié)合量達(dá)5mg IgM。宿主抗體和污染IgG可用凝膠過(guò)濾Superdex 200在精細(xì)純化中去除。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過(guò)濾Superdex 200，很容易去除。血清互補(bǔ)劑如小牛血清可先用蛋白G預(yù)處理，在培養(yǎng)前除去IgG。腹水有大量白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和宿主抗體等。、抗原*單抗多為IgG。離子性去污劑應(yīng)選用與目標(biāo)蛋白相反電荷者，避免在作離子交換時(shí)和目標(biāo)蛋白競(jìng)爭(zhēng)交換介質(zhì)，籍此除去去污劑。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質(zhì)，專為俘獲整個(gè)細(xì)胞或大復(fù)合物，如膜囊等。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。疏水層析是較新技術(shù)，隨著介質(zhì)種類不斷增多，漸被融入各生產(chǎn)工藝中。硫酸氨沉淀方法常被用來(lái)初步凈化樣品，經(jīng)處理過(guò)的樣本處于高鹽狀態(tài)下，很適合直接上疏水層析。將離心、超濾、初純化結(jié)合為一。處理大量原液時(shí)，為避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質(zhì)。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。三] 體積大的樣品，往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。亦可用各種活化偶聯(lián)介質(zhì)偶聯(lián)目標(biāo)蛋白的底物、受體等自制親和介質(zhì)，再用以結(jié)合目標(biāo)蛋白。若對(duì)目標(biāo)蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：一] 使用最通用的凝膠過(guò)濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質(zhì)如Superose、Sephacryl HR依據(jù)分子量將 樣品分成不同組份。分離范圍廣闊的Superose HR預(yù)裝柱很適合測(cè)定未知蛋白的分子量。純化前首先需要測(cè)定生物分子的各物理和化學(xué)特性，然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇出最有效的純化流程。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和產(chǎn)品分離技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展, 建立細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離的耦合系統(tǒng)(圖2) , 能充分利用培養(yǎng)液, 降低生產(chǎn)成本, 一直是人們追求的目標(biāo), 這里就不贅述?！? 灌注培養(yǎng)發(fā)展到現(xiàn)在, 還有許多急待解決的問(wèn)題。3. 4 代謝產(chǎn)物的去除通常使用透析膜, 超濾臘或吸附劑選擇性去除乳酸、氨或銨離子。在細(xì)胞生長(zhǎng)期, 提供充分的營(yíng)養(yǎng), 供
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