動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用技術(shù)(參考版)
2025-08-07 14:27本頁(yè)面
【正文】 從實(shí)際和效益的觀點(diǎn)出發(fā)，液氮溫度（﹣196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。 冷凍保存溫度 冷凍保存溫度是指能長(zhǎng)久保存細(xì)胞的一個(gè)深低溫度。具有滲透性的冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子的物質(zhì)，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。 對(duì)大多數(shù)有核哺乳類動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，在不加冷凍保護(hù)劑的情況下，無(wú)最適冷凍速率可言，也不能獲得活的凍存物。冷凍保護(hù)劑 冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，常被加到一定的溶液中進(jìn)行配制，作為冷凍保護(hù)液。冷凍保存的細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，復(fù)溫速率不當(dāng)也會(huì)降低冷凍存活率。所以一種細(xì)胞冷凍保存之前要測(cè)試出其最適冷凍速度，擬保證獲得最高冷凍存活率。冷凍速率太快或太慢都會(huì)造成細(xì)胞的損傷，只有以最適的冷凍速率冷凍細(xì)胞，才能獲得最佳的冷凍保存效果。要獲得好的凍存與復(fù)蘇效果，必須了解如下幾個(gè)問(wèn)題：冷凍速率、復(fù)溫速率、冷凍保護(hù)劑，冷凍保存溫度。 細(xì)胞間交叉污染為避免細(xì)胞間交叉污染，應(yīng)注意：了解各細(xì)胞系的特征；培養(yǎng)各細(xì)胞系的操作手續(xù)要快速；培養(yǎng)各細(xì)胞系不用同一瓶的培養(yǎng)液和酶等；吸過(guò)培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液的吸管，不能放回儲(chǔ)存培養(yǎng)液和酶的瓶?jī)?nèi)；經(jīng)常檢查培養(yǎng)物特征，注意任何突然的形態(tài)學(xué)改變，通過(guò)染色體或同工酶譜分析，檢查是否有交叉污染。 過(guò)濾法：。 共培養(yǎng)法：與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。3）放射自顯影檢測(cè)：4）DNA分子雜交： 檢測(cè)完畢后，所有實(shí)驗(yàn)用具均應(yīng)經(jīng)過(guò)高壓消毒處理。支原體檢測(cè)方法和處理 1）熒光技術(shù)檢測(cè)：支原體含有DNA，能與一種熒光染料Hoechest 33258特異性的結(jié)合，可根據(jù)細(xì)胞表面的熒光來(lái)顯示細(xì)胞是否污染有支原體。: 支原體污染細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)，改變核酸合成，影響細(xì)胞的抗原性，引起細(xì)胞染色體改變，干擾病毒的復(fù)制，以及具有類病毒作用。 污染物的檢測(cè) ：1）涂片染色鏡檢；2）接種培養(yǎng)：Trypticase大豆肉湯、BHI、Thioglycocollate肉湯和血瓊脂板適于廣泛的細(xì)菌檢測(cè)；Sabouraud肉湯、YM肉湯和營(yíng)養(yǎng)肉湯適于檢測(cè)真菌。3)光鏡觀察到菌絲和顆粒。在出現(xiàn)以下情況時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞可能有污染：1) 培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變。遇到培養(yǎng)污染要分析原因，及時(shí)處理。培養(yǎng)細(xì)胞的污染問(wèn)題及檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)的污染問(wèn)題十分重要，一旦發(fā)生污染，將導(dǎo)致前功盡棄。另外也可能在生物進(jìn)化過(guò)程中DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，使DNA堿基排列序列改變，影響內(nèi)切酶切點(diǎn),使內(nèi)切酶酶切片斷呈多態(tài)性。： 通常采用G6PD(葡萄糖6磷酸脫氫酶)、LDH(乳酸脫氫酶)、核苷磷酸化酶三種方法，根據(jù)條件選擇。： 染色體是一種鑒定細(xì)胞系的種屬、性別來(lái)源較為確切的指標(biāo)；也是檢查細(xì)胞系是否趨于穩(wěn)定，在離體培養(yǎng)條件下細(xì)胞有否發(fā)生轉(zhuǎn)化的可靠指標(biāo)；是區(qū)別正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞的指標(biāo)。 細(xì)胞克隆技術(shù)的方法細(xì)胞系鑒定當(dāng)細(xì)胞系建立后，應(yīng)對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行一系列鑒定后，才能應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等方面的研究。細(xì)胞克隆技術(shù)
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