大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)問題及對(duì)策(存儲(chǔ)版)
【正文】 長期有的細(xì)胞可能會(huì)因比生長速率過大而產(chǎn)生非生產(chǎn)性細(xì)胞, 這時(shí)就應(yīng)控制比生長速率在一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶＞唧w有以下方法。由于葡萄糖的價(jià)格相對(duì)低廉, 這種方法很有前途。3. 3 控制葡萄糖和谷氨酰胺法在細(xì)胞中, 葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝密切相關(guān)。 灌注培養(yǎng)發(fā)展到現(xiàn)在, 還有許多急待解決的問題。若對(duì)目標(biāo)蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：一] 使用最通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質(zhì)如Superose、Sephacryl HR依據(jù)分子量將 樣品分成不同組份。處理大量原液時(shí)，為避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質(zhì)。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。腹水有大量白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和宿主抗體等。*HiTrap IgM是用來純化融合瘤細(xì)胞培養(yǎng)的單抗IgM，結(jié)合量達(dá)5mg IgM。HisTrap試劑盒提供整套HisTag蛋白的純化方法。*近年許多文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質(zhì)上，一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質(zhì)。如離子交換、分子篩、反相層析，更容易分離到單一活性成分。綜合利用分子篩及離子交換層析有助進(jìn)一步獲各組份純品。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設(shè)計(jì)的凝膠過濾預(yù)裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。柱高一般4070cm，整個(gè)過程約半至一小時(shí)。但在高鹽下會(huì)凝集，無法上疏水層析。胞內(nèi)表達(dá)蛋白的核酸問題尤其嚴(yán)重。再用適當(dāng)?shù)碾x子交換介質(zhì)如CM Sepharose FF結(jié)合目標(biāo)蛋白，去除S/D。病毒大都有脂外殼?！鞍字械暮怂岽罅亢怂嵩黾訕颖攫ざ龋顓^(qū)帶擴(kuò)張，反壓增加，降低分辨率和流速。含脂肪A、糖類和蛋白，是帶負(fù)電的復(fù)合大分子。HiPrep Desalting(26ml)可在數(shù)分鐘為多至10ml樣品脫鹽。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產(chǎn)物，并避免凝集和保護(hù)基的脫落。肽類的來源有天然萃取，合成肽和重組肽三種。若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可選擇新一代的Superdex。傳統(tǒng)中藥多是煎熬后服用，有效成份多較為親水，包括生物堿、黃酮、蒽醌、皂甙、有機(jī)酸、多糖、肽和蛋白質(zhì)。SOURCE 30 RPC反相層析介質(zhì)很適合純化復(fù)性前的粗品，并可以1MnaOH重生。2． 蛋白A融合載體使要表達(dá)的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以IgG Sepharose 6 FF純化。宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細(xì)純化中去除。、抗原*單抗多為IgG。疏水層析是較新技術(shù)，隨著介質(zhì)種類不斷增多，漸被融入各生產(chǎn)工藝中。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。分離范圍廣闊的Superose HR預(yù)裝柱很適合測(cè)定未知蛋白的分子量。3. 4 代謝產(chǎn)物的去除通常使用透析膜, 超濾臘或吸附劑選擇性去除乳酸、氨或銨離子。他采用這一方法, 使氨的濃度降低了一半。灌注葡萄糖的同時(shí), 要間歇或連續(xù)地加入其他組分, 以避免營養(yǎng)缺乏, 其中谷氨酰胺要保持在較低水平, 因?yàn)榧?xì)胞的生長不依賴糖酵解 , 即使沒有葡萄糖, 細(xì)胞仍可以通過降解谷氨酰胺獲得能量。所以, 在培養(yǎng)中調(diào)控動(dòng)物細(xì)胞的代謝途徑一直較受重視。分段培養(yǎng)應(yīng)結(jié)合具體的培養(yǎng)條件進(jìn)行。溶氧過高, 細(xì)胞就會(huì)加速消耗營養(yǎng)物質(zhì), 產(chǎn)生許多代謝產(chǎn)物。 而胞內(nèi)pH 升高0. 2 個(gè)單位,可以提高糖酵解速度50%。階段法培養(yǎng)就是根據(jù)這一點(diǎn), 把培養(yǎng)過程分為細(xì)胞生長期和產(chǎn)物生成期, 分別采取不同的培養(yǎng)條件, 以達(dá)到在細(xì)胞生長期使接種細(xì)胞大量繁殖, 提高比生長速率, 盡快獲得高密度細(xì)胞。2. 1 階段培養(yǎng)一般認(rèn)為, 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件應(yīng)盡量模擬來源動(dòng)物體內(nèi)的條件, 而且在培養(yǎng)中通常保持不變。同其他方法相比,灌注培養(yǎng)的產(chǎn)率可以提高一個(gè)數(shù)量級(jí), 并可大大降低勞動(dòng)力消耗。不斷成熟的大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不僅在生產(chǎn)藥用蛋白方面，而且在基因治療、基因疫苗 用的病毒載體的生產(chǎn)、人工器官和組織移植用分化細(xì)胞的培養(yǎng)等研究領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景。用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進(jìn)行在線蛋白質(zhì)含量測(cè)定的方法已經(jīng)完成。離線取樣測(cè)定特別是產(chǎn)物濃度測(cè)定往往需要一天的時(shí)間，因此這種 測(cè)定結(jié)果，不能用來及時(shí)指導(dǎo)生物反應(yīng)器有關(guān)參數(shù)的控制和細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化，而且頻繁取樣容易造成污染，增加費(fèi)用。在CHO細(xì)胞中通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并過量表達(dá)BiP，阻止了未糖基化tPA突變體的分泌。在細(xì)胞早期培養(yǎng)階段，細(xì)胞對(duì)于無血清培養(yǎng)基的適應(yīng)性往往是克隆特異性 的，每個(gè)新的克隆常需要重新配制培養(yǎng)基和適應(yīng)過程。因此一種“細(xì)胞靜止”過程可以有效降低營養(yǎng)成分消耗和代謝毒 物產(chǎn)生，提高CHO細(xì)胞的目的蛋白產(chǎn)率。細(xì)胞死亡與凋亡大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的后期，維持細(xì)胞高的活力是個(gè)富有挑戰(zhàn)性的課題。細(xì)胞系間產(chǎn)率增加幅度不一，對(duì)骨髓瘤細(xì)胞影響較小。細(xì)胞內(nèi)MG的水平由乙二醛縮酶和還原酶兩種酶的活性來平衡，代謝途徑是糖酵解途徑。當(dāng)達(dá)到14％時(shí)便會(huì)阻礙細(xì)胞生長。NADH增加，部分抑制糖酵解。氨抑制Gln代謝途徑，使Asp和Glu消耗增加。由于動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性、相關(guān)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和質(zhì)量以及一致性要求，動(dòng) 物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)仍難于滿足具有重要醫(yī)用價(jià)值生物制品的規(guī)模生產(chǎn)的需求，迫切需要進(jìn)一步研究和發(fā)展細(xì)胞培養(yǎng)工藝。氨來源于兩方面：一是直接來源于培養(yǎng)基，一是細(xì)胞代謝所產(chǎn)生。氨和乳酸對(duì)細(xì)胞的毒性作用已在多種不同的細(xì)胞系有大量報(bào)道，不同細(xì) 胞系對(duì)于這兩種代謝產(chǎn)物的耐受性差別很大，原因可能是不同細(xì)胞系葡萄糖和谷氨酰胺代謝過程中關(guān)鍵酶的敏感性不同，或者在不良生長環(huán)境下，細(xì)胞轉(zhuǎn)換代謝途 徑，特別是氨基酸代謝的改變。當(dāng)CO2分壓升高時(shí)， tPA糖鏈中包含N羥乙酰神經(jīng)氨酸的唾液酸比例稍下降，但tPA的總唾液酸含量、其他單糖含量、tPA的I型II型相對(duì)含量、表面電荷分布和高－甘露糖 單糖比例等影響產(chǎn)品質(zhì)量及一致性的因素在高CO2條件下也沒有改變。用***假單胞菌乙二醛縮酶基因轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中乙二醛縮酶活性增長至三倍多，MG濃度比野 生型CHO低。然而，在 大約400mOsm的范圍內(nèi)，細(xì)胞雖然生長減慢，但特定抗體產(chǎn)生增多，細(xì)胞濃度增大導(dǎo)致最終高產(chǎn)品濃
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