大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)問(wèn)題及對(duì)策(已修改)
2025-06-19 17:37 本頁(yè)面
【正文】 大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的問(wèn)題及對(duì)策大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的問(wèn)題及對(duì)策動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始于本世紀(jì)初，到1962年規(guī)模開(kāi)始擴(kuò)大，發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法，利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價(jià)值 的酶、生長(zhǎng)因子、疫苗和單抗等，已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。由于動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性、相關(guān)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和質(zhì)量以及一致性要求，動(dòng) 物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)仍難于滿足具有重要醫(yī)用價(jià)值生物制品的規(guī)模生產(chǎn)的需求，迫切需要進(jìn)一步研究和發(fā)展細(xì)胞培養(yǎng)工藝。目前，世界眾多研究領(lǐng)域集中在優(yōu)化細(xì) 胞培養(yǎng)環(huán)境、改變細(xì)胞特性、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率并保證其質(zhì)量和一致性上。細(xì) 胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提高細(xì)胞密度的主要限制因素。體外動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中氨離子的積累是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的主要因素之一。氨的積聚使細(xì)胞內(nèi)UDP氨基己 糖(UDPN乙酰葡糖胺和UDPN乙酰半乳糖胺)增加，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)及蛋白的糖基化過(guò)程。氨抑制Gln代謝途徑，使Asp和Glu消耗增加。細(xì) 胞消耗Asp增加，可能是細(xì)胞線粒體膜上蘋(píng)果酸－天冬氨酸泵轉(zhuǎn)運(yùn)NADH加快，使細(xì)胞維持糖酵解途徑的需要。Asp消耗增加可能會(huì)從Gln代謝多經(jīng)天冬氨 酸轉(zhuǎn)氨酶途徑而不是丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶或谷氨酸脫氫酶途徑得以補(bǔ)償。氨來(lái)源于兩方面：一是直接來(lái)源于培養(yǎng)基，一是細(xì)胞代謝所產(chǎn)生。但兩者都涉及谷氨酰胺，因此需 要防止培養(yǎng)基中Gln自然分解，限制Gln用量，并盡量去除培養(yǎng)基中的氨。乳 酸是細(xì)胞糖代謝的產(chǎn)物。高濃度乳酸會(huì)抑制乳酸脫氫酶(LDH），從而減少乳酸產(chǎn)生。LDH受抑制后阻止了NADH向NAD的再生及其偶聯(lián)的丙酮酸/乳酸轉(zhuǎn) 換，從而導(dǎo)致NADH增加。NADH增加，部分抑制糖酵解。乳酸抑制糖酵解也導(dǎo)致低濃度丙酮酸，從而導(dǎo)致Gln消耗減少。由于糖酵解和Gln的分解速度降 低，能量產(chǎn)生減少，更多的能量用于維持離子濃度梯度，因此高乳酸濃度必將抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。氨和乳酸對(duì)細(xì)胞的毒性作用已在多種不同的細(xì)胞系有大量報(bào)道，不同細(xì) 胞系對(duì)于這兩種代謝產(chǎn)物的耐受性差別很大，原因可能是不同細(xì)胞系葡萄糖和谷氨酰胺代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶的敏感性不同，或者在不良生長(zhǎng)環(huán)境下，細(xì)胞轉(zhuǎn)換代謝途 徑，特別是氨基酸代謝的改變。由于Gln和葡萄糖代謝的相互影響，因此降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度以減少乳酸產(chǎn)生的同時(shí)，必須平衡葡萄糖和Gln的比例。這些 代謝改變機(jī)理的研究將有利于設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)目刂品桨?。隨 著細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模和培養(yǎng)密度的增大，由于二氧化碳的產(chǎn)生速率比通過(guò)換氣從培養(yǎng)基中去除二氧化碳快因而導(dǎo)致CO2積聚，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細(xì)胞代 謝水平。CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器中，最適CO2水平為4%～10％。當(dāng)達(dá)到14％時(shí)便會(huì)阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)。在一定的pH條件下，CO2分壓升高會(huì)使 培養(yǎng)基滲透壓升高。常規(guī)/高滲透壓條件下，高CO2分壓使重組CHO細(xì)胞系的生長(zhǎng)和組織型纖溶酶原激活劑(tPA)產(chǎn)率均受到抑制。當(dāng)CO2分壓升高時(shí)， tPA糖鏈中包含N羥乙酰神經(jīng)氨酸的唾液酸比例稍下降，但tPA的總唾液酸含量、其他單糖含量、tPA的I型II型相對(duì)含量、表面電荷分布和高－甘露糖 單糖比例等影響產(chǎn)品質(zhì)量及一致性的因素在高CO2條件下也沒(méi)有改變。這表明CHO細(xì)胞生產(chǎn)tPA具有很強(qiáng)糖基化能力。盡管如此，控制通氣參數(shù)，平衡氧的輸 送及CO2的去除，防止生物反應(yīng)器運(yùn)轉(zhuǎn)中CO2積聚仍是明智選擇。甲 基乙二醛(MG)主要是丙糖磷酸去除磷酸基后的代謝產(chǎn)物，也是脂類(lèi)、氨基酸代謝的產(chǎn)物，對(duì)于細(xì)胞有潛在的損傷作用。MG能改變氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸的氨基 和巰基。細(xì)胞內(nèi)MG的水平由乙二醛縮酶和還原酶兩種酶的活性來(lái)平衡，代謝途徑是糖酵解途徑。葡萄糖濃度很高(100mM)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MG幾乎是正常培養(yǎng)條 件下的兩倍。增加培養(yǎng)基中谷氨酰胺濃度也會(huì)引起MG中度增加。用***假單胞菌乙二醛縮酶基因轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中乙二醛縮酶活性增長(zhǎng)至三倍多，MG濃度比野 生型CHO低。然而，MG濃度降低的細(xì)胞與在典型生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件下的細(xì)胞的生長(zhǎng)活力有何不同尚未確定。通過(guò)批次培養(yǎng)中限制葡萄糖用量來(lái)降低葡萄糖消 耗，由此來(lái)確定降低糖酵解代謝是否導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MG濃度降低，從而最終確定MG濃度降低是否提高培養(yǎng)活力或影響產(chǎn)品特性的研究具有重要意義。另外，培養(yǎng)基中 加入胎牛血清可降低MG濃度。不管用NaCl、KCl還是蔗糖升高滲透壓，均可增加批次培養(yǎng)中抗體濃度。細(xì)胞系間產(chǎn)率增加幅度不一，對(duì)骨髓瘤細(xì)胞影響較小。高滲透壓不僅影響細(xì)胞批次 培養(yǎng)中抗體或tPA產(chǎn)量，而且影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短、細(xì)胞死亡的速度。由于細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境不斷變化，有關(guān)滲透壓影響的量化進(jìn)展不大。然而，在 大約400mOsm的范圍內(nèi)，細(xì)胞雖然生長(zhǎng)減慢，但特定抗體產(chǎn)生增多，細(xì)胞濃度增大導(dǎo)致最終高產(chǎn)品濃度。另外，在培養(yǎng)基中加入諸如甘氨酸甜菜堿、三甲基甘氨酸或脯氨酸等滲透壓保護(hù)劑在一定程度上減輕了高滲透壓對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，但不影響細(xì)胞表達(dá)目的蛋白質(zhì)的水平，同時(shí)可使細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間的維持高水平表達(dá)。多孔微載體的研制替代了容易使細(xì)胞受機(jī)械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。為創(chuàng)造更大優(yōu)勢(shì)，多孔微載體內(nèi)部保護(hù)空間必須保證細(xì)胞能夠進(jìn)入生長(zhǎng)。對(duì)于有些細(xì)胞株 盡管能貼在微載體內(nèi)，但“移動(dòng)性”很差，因此需要發(fā)明一種更好的培養(yǎng)方式，提高微孔的開(kāi)放性或者改善其表面特性，從而提高細(xì)胞貼壁率同時(shí)增加細(xì)胞移動(dòng)性。細(xì)胞死亡與凋亡大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的后期，維持細(xì)胞高的活力是個(gè)富有挑戰(zhàn)性的課題。最初的研究似乎表明細(xì)胞死亡大多由于壞死，而人們逐漸認(rèn)識(shí)到至少是一些細(xì)胞系在生物反應(yīng) 器中細(xì)胞死亡主要原因是細(xì)胞凋亡。隨著細(xì)胞凋亡分子機(jī)制研究的不斷深入，細(xì)胞凋亡的發(fā)生被認(rèn)為是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的重要制約環(huán)節(jié)，預(yù)防并控制細(xì)胞凋亡也 因此成為研究熱點(diǎn)。用基因工程方法將bcl2基因這種細(xì)胞凋亡抑制基因?qū)爰?xì)胞，成為眾多研究者的選擇。bcl2基因的過(guò)量表達(dá)能抑制Gln或氧缺乏引起的細(xì)胞凋亡， 減少細(xì)胞特定營(yíng)養(yǎng)成分的消耗，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)量,這對(duì)于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)具有重大意義。對(duì)細(xì)胞的這種保護(hù)作用依賴(lài)于bcl2等抑制基因的高水平 表達(dá)。因此，需要尋求在低表達(dá)水平便可達(dá)到目的的更強(qiáng)的細(xì)胞凋亡抑制基因。在大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，細(xì)胞凋亡/死亡多是在營(yíng)養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多時(shí)發(fā)生。因此一種“細(xì)胞靜止”過(guò)程可以有效降低營(yíng)養(yǎng)成分消耗和代謝毒 物產(chǎn)生，提高CHO細(xì)胞的目的蛋白產(chǎn)率。方法是向CHO細(xì)胞中導(dǎo)入p2p27的基因，使細(xì)胞周期中G1期延長(zhǎng)(細(xì)胞靜止)，改造后，細(xì)胞活力正常，外 源基因表達(dá)蛋
教學(xué)教案相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1