【正文】 不適當(dāng)?shù)闹虚g折疊體高濃度聚集在一起形成的不溶物。：降低細(xì)胞生長溫度；共表達(dá)分子伴侶；改變滲透壓；融合蛋白： 用變性劑使之成為可溶性的伸展的肽鏈，然后再在適當(dāng)?shù)臈l件下復(fù)性折疊成天然的、有活性的蛋白質(zhì)分子。分離包涵體224。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)型復(fù)原：(1)帶電顆粒的性質(zhì)：即凈電荷數(shù)量、顆粒大小及形狀。(3)溶液的pH值：決定帶電顆粒的解離程度，亦即決定所帶凈電荷的多少。(5)電滲：在電場中，由于多孔支持物吸附水中的正或負(fù)離子使溶液相對(duì)帶電，在電場作用下，溶液就向一定的方向移動(dòng).(6)支持介質(zhì)的選擇：(7)其它因素：:(1)．在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，含有三種離子，兩種不同孔徑的凝膠，兩種或兩種以上不同pH的緩沖溶液.(2)．所謂不連續(xù)就是指凝膠濃度不一樣，緩沖液離子成分及pH不一樣。由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。 (3)電位梯度的不連續(xù)性：在不連續(xù)系統(tǒng)中，電位梯度的差異是自動(dòng)形成的。在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續(xù)性，是為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率。： SDS作用：1）與蛋白牢固結(jié)合，由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電荷，使得樣品中各種蛋白質(zhì)與SDS形成的SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)分子間天然的電荷差異；2）SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物分子構(gòu)型也幾乎相同，而且具有相同的荷質(zhì)比，因此在SDSPAGE中，SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳遷移率只與菌、酵母等的破碎。注意: 超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使敏感的活性物質(zhì)變性失活，另外噪聲也比較大。 ：絕大多數(shù)細(xì)胞被破壞，一般適用于從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)。 ：常用的有十二烷基磺酸鈉、TritonX100、去氧膽酸鈉等。 ：有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子之間不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度的降低；另外有機(jī)溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中沉淀析出。 2）根據(jù)分子量的不同分離：.； ； 。 4）親和層析。：1）分配層析柱象分餾柱一樣可以分成很多層，每層為一理論塔板，其高度為理論塔板高度。 待分離物質(zhì)的存在也不影響其他物質(zhì)的分配；4）在分配層析柱上，物質(zhì)在各個(gè)理論塔板中的含量可通過計(jì)算求得。19 .聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)：聚丙烯酰胺凝膠的性能：1）機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性透明，相對(duì)地化學(xué)穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定，在很多溶劑中不溶，是非離子型的；2）沒有吸附和電滲作用. 通過改變濃度和交聯(lián)度，可以控制孔徑變化在極廣泛的范圍，并且制備凝膠的重復(fù)性好；3）由于純度高及不溶性，還適合于少量樣品的制備， 不致污染樣品。 可能出現(xiàn)的問題及解決措施：1）條帶過淡：上樣量不足；染色操作錯(cuò)誤；2）條帶丟失：電泳時(shí)間過長，小條帶已跑出膠；膠濃度不正確。4）條帶模糊：被降解。5）條帶位置錯(cuò)誤：被降解；上樣量過大；電泳條件不正確；上樣前加熱不夠；還原劑失效。7）條帶擴(kuò)散：電壓過低，電泳時(shí)間過長；緩沖液離子強(qiáng)度太低；樣品本身結(jié)構(gòu)不均一。9）拖尾：樣品溶解不充分；膠板不干凈。 五、酵母細(xì)胞雙雜交系統(tǒng)：1）酵母雙雜交；2）親和層析；3）免疫共沉淀；4）蛋白質(zhì)交聯(lián)；5）基于GFP的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究方法；6）噬菌體顯示系統(tǒng)篩選。單獨(dú)的BD雖然能和啟動(dòng)子結(jié)合,但不能激活轉(zhuǎn)錄。與調(diào)控目的基因有關(guān)的兩個(gè)蛋白質(zhì)X蛋白與Y蛋白,將X蛋白的編碼基因與BD結(jié)構(gòu)域基因融合(表達(dá)所得的融合蛋白為”誘餌”蛋白), ,Y蛋白的編碼基因與AD結(jié)構(gòu)域基因融合(表達(dá)所得的融合蛋白稱為”獵物”蛋白)。(2)．具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)告基因。(2)．基因組中引入額外的報(bào)告基因LEU、TRP、HIS。：1）表達(dá)“誘餌”和“獵物”蛋白；2）檢驗(yàn)這兩種蛋白表達(dá)后能否激活酵母中的報(bào)告基因做法：首先構(gòu)建能表達(dá)“誘餌”和“獵物”蛋白的表達(dá)載體。：(1)．高敏感性；(2)．真實(shí)性；(3) 簡潔性；（4）廣泛性。原因：①采用高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體，使融合蛋白過量表達(dá)；②激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又與啟動(dòng)子結(jié)合，此三元復(fù)合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定；③通過mRNA使信號(hào)放大； ④檢測的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積效應(yīng)，可檢測存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時(shí)的相互作用。檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化時(shí)期的材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析不同亞細(xì)胞部位和功能的蛋白質(zhì)，適用于部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白。(2)對(duì)蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測蛋白質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)突變或缺失突變?cè)龠M(jìn)行雙雜交。(4) 分析新基因的生物學(xué)功能。(5) 繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜。：1）假陽性較多；2）轉(zhuǎn)化效率偏低；3）陰性干擾。 原因：①BD融合誘餌蛋白的單獨(dú)激活作用。②如AD融合靶蛋白有DNA的特異性結(jié)合，則可單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。 排除假陽性的措施：①作嚴(yán)格的對(duì)照試驗(yàn)。②采用多個(gè)報(bào)告基因，且每個(gè)報(bào)告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同。③報(bào)告基因整合到染色體上，可使基因表達(dá)水平穩(wěn)定。適當(dāng)增加濃度可減少假陽性。 原因：（1）融合蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性時(shí)，應(yīng)選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體；（2）蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。：(1)某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì)。(2)某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達(dá)或不能準(zhǔn)確定位到胞核內(nèi)。(3)雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行。(5) 哺乳動(dòng)物蛋白之間相互作用有時(shí)要求正確的折疊和翻譯后修飾，而酵母細(xì)胞不能提供這樣的環(huán)境。陽性克隆必須進(jìn)行體外翻譯和表達(dá)，用抗原表位特異性的抗體進(jìn)行共定位研究. 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過其它的實(shí)驗(yàn)手段來驗(yàn)證。當(dāng)Gal4的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們?cè)诳臻g上充分接近，則能恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個(gè)結(jié)合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。：原理 ：利用靶DNA序列，捕獲具有與該元件特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。 應(yīng)用：研究DNA蛋白質(zhì)相互作用。②分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點(diǎn)蛋白的新基因。 ：該系統(tǒng)是一項(xiàng)鑒定阻斷蛋白間相互作用的技術(shù)，核心在于構(gòu)建一種反向篩選的報(bào)告基因。在此情況下BDX/ADY作用的解離賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢。 應(yīng)用：1）用于篩選缺陷等位基因的研究：在穩(wěn)定、全長及能夠形成正確蛋白質(zhì)折疊的條件下，已有了幾種遺傳學(xué)策略來篩選作用缺陷性等位基因；2）在反式作用解離分子方面的應(yīng)用；3）在蛋白質(zhì)組研究方面的應(yīng)用：利用反向雙雜交系統(tǒng)對(duì)文庫進(jìn)行預(yù)清除，則可能大大減輕以后的假陽性鑒定工作。 ：基本原理：構(gòu)建3個(gè)雜交體：1） BD與一個(gè)位點(diǎn)特異的RNA結(jié)合蛋白融合，可結(jié)合到報(bào)告基因上；2） RNA(Y)，含有“誘餌”順序，且可結(jié)合到BD融合的蛋白質(zhì)上；3）與AD融合的X蛋白。 種類：兩個(gè)融合蛋白的相互作用必須借助于第三種分子，而這第三種分子可以是蛋白質(zhì)、小分子多肽和核酸，因而產(chǎn)生了：1）蛋白質(zhì)三雜交系統(tǒng)；2）激酶三雜交系統(tǒng)；3）小配體三雜交系統(tǒng)；4）RNA三雜交系統(tǒng)。：(1)有自身的復(fù)制子，能借助自身的復(fù)制和調(diào)控對(duì)攜帶的目的基因進(jìn)行復(fù)制和增殖。(3)有多個(gè)利于選擇和篩選的遺傳表型或標(biāo)志，包括抗藥性、營養(yǎng)缺陷型、噬菌斑形成及顯色反應(yīng)。：（一）按功能分類：1）克隆型載體； 2）表達(dá)型載體。 （三）按載體來源分類：質(zhì)粒載體，噬菌體載體，病毒載體，酵母人工染色體，粘性載體。：1）氨芐青霉素抗性基因（ampr）:編碼β內(nèi)酰胺酶，水解amp β內(nèi)酰胺環(huán)使amp失效；2）四環(huán)素抗性基因（tetr）：編碼轉(zhuǎn)膜泵將tet從細(xì)胞移出； 3）大腸桿菌LacZ基因：編碼半乳糖苷酶，分解Xgal，使菌落為藍(lán)色。② l噬菌體的成熟需要包裝，當(dāng)與外源DNA重組后的大小介于原來的75%～105%之間時(shí)，重組的DNA分子才可包裝為成熟的噬菌體顆粒。 用途：構(gòu)建真核生物基因組DNA文庫：1）標(biāo)準(zhǔn)的酶切體系：1μgDNA，20μl總反應(yīng)體積，1U酶，推薦的Buffer和溫度，反應(yīng)1h； 2）酶切體系組成：內(nèi)切酶 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇，保存，使用，稀釋（避免失活與污染）； DNA底物純度，含量； 反應(yīng)buffer 嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書 高、中、低鹽； 3）酶切溫度與時(shí)間：一般為37℃, 1h； 4）酶切反應(yīng)過程：容積：20μl，50μl, 酶容積≤10%, 即甘油≤ 5%；注意混勻；反應(yīng)終止：三種方法 :①10mM %SDS。 ③酚/氯仿抽提，乙醇沉淀； 酶切鑒定 ：瓊脂糖凝膠電泳：大腸桿菌DNA聚合酶I大片段，缺5′→ 3′外切酶活性。 主要功能與用途：①催化兩個(gè)獨(dú)立DNA片段(粘性末端和平末端) 5′P和3′OH之間形成磷酸二酯鍵。②修復(fù)雙鏈DNA分子中單鏈缺口。 用途：1）主要作用是在載體或目的基因 3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重組。：催化DNA，RNA以及核糖和脫氧核糖三磷酸上的 5′ 磷酸基團(tuán)水解。：1）cDNA文庫(C文庫)用基因克隆的方法保存在宿主細(xì)胞中的DNA重組體的群體，每一重組子只含一種mRNA信息，這些重組子的總和包含某種生物的全部mRNA序列。3）分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術(shù)。2）適用于氨基酸殘基數(shù)目較少的蛋白基因。：1）限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)添加法； 2）T/A克隆法：1）粘性末端連接法：適用于插入片段和載體具有相同的粘性末端。 2）平頭末端連接法：適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點(diǎn)。4）同聚物接尾法：適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點(diǎn)。 程序： 限制性內(nèi)切酶消化DNA→瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段→轉(zhuǎn)印到NC膜或尼龍膜→堿變性、中和→預(yù)雜交、雜交→放射性自顯影. 其基本原理毛細(xì)管轉(zhuǎn)移: 將RNA樣品變性和通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到NC膜等固相載體上，用標(biāo)記的DNA或RNA特異探針對(duì)固定在膜上的RNA進(jìn)行雜交。 不同點(diǎn)：(變性方法) Northern印跡雜交：聚乙二醛、二甲亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞。具有一定同源性的兩條核酸單鏈在適宜的條件（溫度及離子強(qiáng)度）下可以按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則退火形成雙鏈分子，由此可用來檢測核酸分子存在與否。 核酸分子雜交應(yīng)用：1）基因克隆的篩選；2）酶切圖譜的制作；3）基因組中特定基因序列的定量和定性分析；4）基因突變分析；5）疾病的診斷。:(1).高度靈敏性。(3).具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性，能耐較高溫度和保存時(shí)間。(5).標(biāo)記及檢測方法簡單。(7).價(jià)格低廉。 缺點(diǎn)：1）半衰期短, 隨用隨標(biāo)；2）放射性污染。 缺點(diǎn)：1）靈敏度不太高；2）特異性不太高。:(1)DNA的切口平移標(biāo)記法。(3)RNA探針的標(biāo)記。(5)cDNA探針的標(biāo)記：在反轉(zhuǎn)錄過程中選用反轉(zhuǎn)錄酶, 加入標(biāo)記的核苷酸, 引物可以特定的,也可以是隨機(jī)六核苷酸, 或oligo dT。，隨機(jī)引物標(biāo)記法，DNA的3′末端標(biāo)記等均為延長核苷酸的反應(yīng)，而且要讓32P進(jìn)入鏈中，故應(yīng)選擇[α32P]dNTP， 50μci/反應(yīng)，無特殊原因首選[α32P]dCTP。:酶法(U)與化學(xué)法(C)生物素標(biāo)記方法:參入標(biāo)記法(隨機(jī)引物法或缺口翻譯法)與光敏生物素標(biāo)記法。:Dig+dUTP→ DigdUTP DigdUTP標(biāo)記DNA方法: 切口平移法與隨機(jī)引物標(biāo)記法檢測方法: DigDNA探針+抗Dig抗體ALP或HRP+底物（BCIP+NBT）。七、DNA的P C R：類似于DNA的天然復(fù)制過程，是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板5`末端和3`末端相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸，直至完成新的DNA合成，反復(fù)重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。：(1)．DNA模板變性 (denature)：95℃左右高溫使模板DNA完全變性。(3)．引物的延伸 (extension)：DNA聚合酶在最適溫度下催化DNA合成反應(yīng)。端是人工合成的引物，是特定的，3 39。：1）高度的敏感性：是最主要的特點(diǎn)，25個(gè)循環(huán)可擴(kuò)增106倍，它可對(duì)單拷貝、單根頭發(fā)、一滴血等微量標(biāo)本進(jìn)行分析；2）高度的特異性：取決于2個(gè)引物設(shè)計(jì)的好壞，依賴于引物與模板結(jié)合的正確性，退火溫度；3）操作簡便、快捷；4）適用樣品的廣泛性。引物的常用濃度范圍：～1μmol/L，在100μl中引物的量為25～100 pmol, 假如用25μmol/L濃度的引物貯備液只需加1～ 4μl。：1）引物長度在15～30個(gè)堿基；2）引物的堿基的分布是隨機(jī)的, 避免5個(gè)以上的嘌啶和嘧啶的連續(xù)排列, 尤其3 39。端；4）引物自身不應(yīng)有連續(xù)超過3個(gè)bp的互補(bǔ)序列；5）引物的3 39。決定產(chǎn)物的特異性；6）引物的5 39。端可進(jìn)行修飾；7）引物與非擴(kuò)增序列同源性應(yīng)70%或連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)；8）擴(kuò)增編碼區(qū)中,引物3 39?！捌脚_(tái)效應(yīng)”出現(xiàn)的早晚取決于：1。模板DNA的拷貝數(shù)；3。其他多種因素7. PCR的條件優(yōu)化：1）PCR循環(huán)數(shù)；2）使用增強(qiáng)劑（DMSO，PEG6000，甲酰胺，甘油，Tween20）；3）熱啟動(dòng)PCR。八、外源基因的表達(dá)：酵母、昆蟲（果蠅與非果蠅類）、哺乳動(dòng)物。 2)轉(zhuǎn)染:（一）化學(xué)法:磷酸鈣共沉淀法, DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法, 脂質(zhì)體介導(dǎo)法, 醋酸鋰法. （二）物理法:電穿孔技術(shù), 顯微注射技術(shù).：1）瞬時(shí)表達(dá)（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染），特點(diǎn)：外源DNA未與宿主染色體整合，維持時(shí)間短(23天)； 2）穩(wěn)定表達(dá)（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染），特點(diǎn)：外源DNA已整合入宿主細(xì)胞染色體, 其轉(zhuǎn)染的目的是獲得穩(wěn)定表達(dá)外源目的基因的單細(xì)胞克隆。：1）研究目的: 研究啟動(dòng)子和調(diào)控元件所選的報(bào)告基因載體的組成不同，前者的載體不含啟動(dòng)子，后者則相反。3）. 篩選標(biāo)記的選擇；4）. 宿主選擇: 依據(jù)啟動(dòng)子與宿主的相容性來選擇。：（一）穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞：：L細(xì)胞、Ltk細(xì)胞、NIH 3T3細(xì)胞、Sp2/0和NSO細(xì)胞、CHO細(xì)胞等；：HEK29HeLa、