【正文】 r):是細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)能特異識(shí)別生物活性分子并與之結(jié)合，進(jìn)而引起生物學(xué)效應(yīng)的特殊蛋白質(zhì)。 配體：神經(jīng)遞質(zhì) 舉例：乙酰膽堿受體 GPCR 此類受體接受的信息 需G蛋白的轉(zhuǎn)換才能傳遞到靶細(xì)胞內(nèi)，即與G蛋白偶聯(lián)。 N 端常被糖基化 C端常被棕櫚酰化 配體結(jié)合域胞內(nèi)域與G蛋白偶聯(lián) 受體酪氨酸蛋白激酶(RTKs/TPKs) 非酪氨酸蛋白激酶受體(NonTPK receptors) 不具有TPK活性，與酪氨酸蛋白激酶偶聯(lián) 功能: 細(xì)胞分化、增殖和癌變二、胞內(nèi)受體 胞內(nèi)受體通常為反式作用因子(transacting factors) LR →順式作用原件→調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄 配體：類固醇激素，甲狀腺素受體作用特點(diǎn)：高特異性(High specificity)高親和力(High affinity)可飽和性(Saturability) 可逆性(Reversibility) 可調(diào)節(jié)性 G蛋白是鳥苷酸結(jié)合蛋白(guanine nucleotide binding protein)的簡(jiǎn)稱。磷蛋白磷酸酶(Protein Phosphatase, PP) 使被磷酸化的蛋白質(zhì)脫去無機(jī)磷酸鹽，回復(fù)基本狀態(tài)。PKA調(diào)節(jié)基因表達(dá)順式作用元件: cAMP應(yīng)答元件(cAMP response element, CRE) TGACGTCA 反式作用因子: cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)CREB結(jié)合蛋白(CREBbinding protein,CBP) PKA的C亞基進(jìn)入細(xì)胞核→磷酸化CREB的Ser/Thr殘基→pCREBCRE→ CBPpCREBCRE →調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄Ca2+PKC途徑 第一信使——G蛋白偶聯(lián)受體 ——PLC （磷脂酶C）PIP2——IP3+DAG——第二信使：IPDAG、Ca2+——PKC 鈣依賴性蛋白激酶(Ca2+ dependent protien kinase, PKC)或蛋白激酶C，調(diào)節(jié)代謝：磷酸化靶蛋白的Ser/Thr殘基 靶蛋白：膜受體，膜蛋白和多種酶 n 舉例 PKC磷酸化質(zhì)膜的Ca2+通道→ Ca2+內(nèi)流→胞漿內(nèi)[Ca2+]↑；PKC磷酸化肌漿網(wǎng)的Ca2+ATP酶→ Ca2+進(jìn)入肌漿網(wǎng)→胞漿內(nèi)[Ca2+]↓ 調(diào)節(jié)基因表達(dá)：早期反應(yīng)：磷酸化立早基因的反式作用因子→促進(jìn)立早基因的表達(dá)→早期反應(yīng)；立早基因: 細(xì)胞原癌基因(cfos, AP1/cjun)第三信使: cfos蛋白, AP1/cjun蛋白晚期反應(yīng)：第三信使磷酸化→晚期反應(yīng)基因活化→晚期反應(yīng) 生物學(xué)效應(yīng)：IP3:從膜上擴(kuò)散到胞漿中→與ER的受體結(jié)合→鈣通道打開→胞漿內(nèi)[Ca2+] ↑； DAG: PS, Ca2+的協(xié)助下，激活PKC cGMPPKG途徑 第一信使: 心房肽、鳥苷素、NO—— GC 鳥苷酸環(huán)化酶—— 第二信使：cGMP ——PKG——生物學(xué)效應(yīng)Ca2+CaM途徑 第一信使——受體——第二信使：Ca2+——CaM——生物學(xué)效應(yīng)四個(gè)Ca結(jié)合區(qū)，與Ca結(jié)合后，即引起構(gòu)象改變從而引起其與受體蛋白的作用而表現(xiàn)CaM的生物活性。許多刺激因子如細(xì)胞因子，氧自由基等均可使其活化。同時(shí)PKAc使NFκB亞基磷酸化，解離，使NFκB活化，轉(zhuǎn)移入胞核，并與DNA的κB反應(yīng)元件結(jié)合，從而調(diào)節(jié)特異基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。常用工具酶：限制性內(nèi)切酶（RE）是一類特異性水解雙鏈DNA的磷酸二酯酶。RNA聚合酶：轉(zhuǎn)錄酶，體外DNA轉(zhuǎn)錄成RNA所必需。DNA連接酶：將兩段DNA分子拼接的酶叫DNA連接酶?；蚩寺∈怯梅蛛x純化或人工合成的基因DNA片段，在體外與載體DNA連接，將重組DNA分子，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，經(jīng)過擴(kuò)增、篩選、鑒定等程序，獲得含重組DNA的活細(xì)胞。三、 基因?qū)敕?體外連接的重組DNA分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才能大量復(fù)制、增殖和表達(dá)。 氯化鈣法；電穿孔法；轉(zhuǎn)染試劑法；顯微注射法四、 重組體的篩選與鑒定 從轉(zhuǎn)化菌落中，篩選含有陽性重組體的菌落并鑒定重組體的正確性，通過細(xì)胞培養(yǎng)，重組體的擴(kuò)增，獲得足量靶基因片段，供進(jìn)一步研究該基因及其表達(dá)產(chǎn)物的機(jī)構(gòu)、功能。突變分類：：點(diǎn)突變 DNA被化學(xué)修飾或復(fù)制時(shí)發(fā)生錯(cuò)配 ，使一個(gè)堿基變成另一個(gè)堿基。錯(cuò)義突變：堿基序列的改變引起AA序列改變。3．表型特征:形態(tài)突變: 突變主要影響生物體的外在可見的形態(tài)結(jié)構(gòu)，故又稱可見突變。 生化突變: 突變影響生物的代謝過程。致死突變: 影響生物體的生活力，導(dǎo)致個(gè)體死亡的一類突變。在發(fā)育過程中，體細(xì)胞突變事件發(fā)生的愈早，對(duì)表型的影響就愈大。生殖細(xì)胞突變：生殖細(xì)胞突變發(fā)生在種系(germ line)中?；蛲蛔兲卣鳎?(一) 突變的平行性、重演性和可逆性平行性 是指親緣關(guān)系相近的物種因遺傳基礎(chǔ)較近似而發(fā)生相似基因突變的現(xiàn)象。可逆性 基因突變的發(fā)生方向是可逆的。隱性基因a ；★反突變(reverse mutation)： 隱性基因a232。 (二) 突變的多方向性與復(fù)等位基因突變的多方向性：指基因突變可以多方向發(fā)生，即基因內(nèi)部多個(gè)突變部位分別改變后會(huì)產(chǎn)生多種等位基因形式。在二倍體與異源多倍體中，同一位點(diǎn)只能有一對(duì)基因，最多存在兩種等位基因形式；因此復(fù)等位基因的各種形式會(huì)存在于生物群體的不同個(gè)體中 (三) 隨機(jī)性——生物個(gè)體發(fā)育的任何時(shí)期 體細(xì)胞突變 ——不遺傳給后代 生殖細(xì)胞突變——遺傳給后代 (四) 廣泛性和有害性（多數(shù)）定點(diǎn)突變技術(shù)：在體外條件下定向誘發(fā)突變，制造點(diǎn)特異突變，然后導(dǎo)入生物體內(nèi)，觀察并分析這些突變的表型。為了使靶基因的特點(diǎn)位點(diǎn)發(fā)生突變，所設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物的序列除了所需的突變堿基外，其余的序列則與靶基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補(bǔ)。在dut，ung 雙缺陷的大腸桿菌中培養(yǎng)重組M13噬菌體，制備的單鏈模板DNA含有許多U堿基，DNA聚合酶，dNTP，DNA連接酶，合成的新鏈則不含U而含T，轉(zhuǎn)染野生型大腸桿菌ung + 結(jié)果含U的模板在尿嘧啶脫糖苷酶的作用下發(fā)生鏈的斷裂而被破壞。 用硫代磷核苷酸,在DNA聚合酶催化和DNA連接酶作用下，形成異源dsDNA分子，再用NciⅠ消化該異源dsDNA分子，可獲的高效率的定點(diǎn)突變分子。需兩個(gè)突變誘導(dǎo)引物，兩個(gè)側(cè)翼引物，3次PCR。這些基因在正常情況下不表達(dá)或僅限量表達(dá)，當(dāng)其被激活時(shí)則可引起癌變，通常將病毒中的這類癌基因稱為病毒癌基因(vonc)，細(xì)胞中存在的癌基因稱為細(xì)胞癌基因(conc),由于conc在正常細(xì)胞中以非激活狀態(tài)存在，故又稱為原癌基因(protoonc). 原癌基因：未激活的細(xì)胞癌基因在人體正常細(xì)胞中存在是一種正?；蜃饔?，可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，廣泛存在于生物界中，從酵母到人的細(xì)胞中都存在。它不編碼病毒的結(jié)構(gòu)成分，對(duì)病毒的復(fù)制也沒有作用，但其異常表達(dá)可以使宿主細(xì)胞持續(xù)增殖, 產(chǎn)生腫瘤或使培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞的動(dòng)物病毒基因。在正常細(xì)胞內(nèi)可以表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化的功能。：病毒癌基因無內(nèi)含子；細(xì)胞癌基因有內(nèi)含子。 : 病毒癌基因?qū)Σ《颈旧頍o關(guān)緊要，卻可使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化，引起腫瘤，而細(xì)胞癌基因?qū)?xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能活動(dòng)卻是至關(guān)緊要的癌基因的激活機(jī)理 1. 點(diǎn)突變：原癌基因在射線或化學(xué)致癌劑作用下，可能發(fā)生單個(gè)堿基的替換導(dǎo)致點(diǎn)突變，從而改變了表達(dá)蛋白的氨基酸組成，造成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)異常。 ras基因的點(diǎn)突變可導(dǎo)致多種腫瘤： Hras點(diǎn)突變導(dǎo)致膀胱癌、甲狀腺癌、宮頸癌、肺癌 K ras點(diǎn)突變導(dǎo)致結(jié)腸癌、肺腺癌、胰腺癌、膽管癌 N ras點(diǎn)突變導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、急性淋巴母細(xì)胞白血病等 ：插入具有高活性的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，使原癌基因持久、過量地表達(dá) n 逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR含較強(qiáng)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。原癌基因擴(kuò)增使轉(zhuǎn)錄模板增加，mRNA的水平增高，表達(dá)活性增加，產(chǎn)生過量的表達(dá)蛋白而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。易位導(dǎo)致原來無活性的原癌基因移至啟動(dòng)子或增強(qiáng)子附近而激活。 不同的癌基因有不同的激活方式，一種癌基因也可有幾種激活方式。 抑癌基因：一類抑制細(xì)胞過度生長(zhǎng)、增殖，從而遏制腫瘤形成，當(dāng)其缺失或變異抑癌功能喪失導(dǎo)致腫瘤生成的基因，也稱為腫瘤抑制基因或隱性癌基因。Rb基因的作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期 pRB具有兩種形式: 磷酸化與非磷酸化 非磷酸化的P105為非活性型, 可抑制細(xì)胞增殖，磷酸化的P105為活性型可促進(jìn)細(xì)胞增殖Rb基因?qū)δ[瘤的抑制作用與轉(zhuǎn)錄因子E2F有關(guān)E2F是一類激活轉(zhuǎn)錄作用的活性蛋白，控制著S期的重要蛋白質(zhì)的合成（如DNA合成酶），在G0、G1期，低磷酸化型的Rb蛋白與E2F結(jié)合成復(fù)合物，使E2F處于非活化狀態(tài)；在S期，Rb蛋白被磷酸化而與E2F解離，E2F變成游離狀態(tài)，細(xì)胞立即進(jìn)入增殖階段。p53基因 定位 ，長(zhǎng)20kb,有11個(gè)外顯子，10個(gè)內(nèi)含子。8分別編碼五個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域（ⅠⅤ）：1319，117143，171181，236258，270286。 P53蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)可分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域： 216。 216。 216。 P53的生物學(xué)功能： 抑制細(xì)胞增殖 P53基因時(shí)刻監(jiān)控著基因的完整性，一旦細(xì)胞DNA遭到損害，P53蛋白與基因的 DNA相應(yīng)部位結(jié)合，起特殊轉(zhuǎn)錄因子作用，活化 p21基因轉(zhuǎn)錄，P21蛋白與cyclinE/CDK2結(jié)合抑制該激酶的活性和其對(duì)PRb的磷酸化，使細(xì)胞停滯于G1期。促進(jìn)DNA損傷修復(fù)： 當(dāng)DNA因各種物理、化學(xué)因素引起DNA損傷時(shí)， P53蛋白與受損DNA部位結(jié)合，起特殊轉(zhuǎn)錄因子的作用，活化GADD45基因轉(zhuǎn)錄修復(fù)DNA。 GADD45蛋白也可以P21/CDK/ GADD45蛋白/PCNA四聚體形式，促使DNA修復(fù) P53蛋白還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：當(dāng)DNA損傷不能修復(fù)時(shí)，P53可誘導(dǎo)Bax基因表達(dá) ， 形成Bax / Bax 復(fù)合體，因Bax基因具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 第十四章 基因診斷和基因治療基因診斷：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),從DNA/RNA水平檢測(cè)分析致病基因的存在,變異和表達(dá)狀態(tài)從而對(duì)疾病作出診斷的技術(shù) 二、基因診斷的特點(diǎn)針對(duì)性強(qiáng)： 以探測(cè)疾病基因?yàn)槟繕?biāo)，屬于“病因診斷” 。而且待測(cè)標(biāo)本微量。 基因探針可為任何來源，任何種類，探針序列可為已知亦可未知，檢測(cè)目標(biāo)可為內(nèi)源基因亦可外源基因，診斷范圍廣?；蛟\斷的基本流程：制備基因探針； 提取目的基因，獲得單鏈DNA； PCR擴(kuò)增DNA； 目的DNA與尼龍膜結(jié)合； 探針與目的DNA互補(bǔ)配對(duì)； 沖洗尼龍膜； 檢測(cè)雜合分子基因診斷的基本技術(shù) 一、核酸分子雜交（hybridization）根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，將樣品DNA/RNA雙鏈經(jīng)變性處理，加入已標(biāo)記的單鏈DNA/RNA探針，樣品中與探針互補(bǔ)的DNA/RNA序列可與探針形成雜交雙鏈DNA，通過顯示標(biāo)記物或其它方法來檢測(cè)特定的核酸片段。直接用培養(yǎng)/采集的細(xì)胞（涂載玻片上）、組織切片（固定載玻片上）和細(xì)菌菌落（復(fù)印至濾膜上）與標(biāo)記核酸探針雜交。還可觀察被測(cè)基因在細(xì)胞內(nèi)或染色體上的定位。通過纖維素膜雜交斑點(diǎn)的放射自顯影或膠片斑點(diǎn)的光吸收值掃描可以測(cè)定待檢核酸的含量。Southern 印跡雜交 將制備的DNA經(jīng)酶切電泳、再轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針雜交后進(jìn)行檢測(cè)的方法，用于 DNA/DNA雜交。 三個(gè)步驟：變性(denaturation) 退火(annealing)延伸(extension)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP) 限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別特定的DNA序列，并在其中的某一特定堿基位點(diǎn)（限制性位點(diǎn)）將DNA切斷，使 DNA形成限制性片段.RFLP技術(shù)診斷疾病的機(jī)理:由于基因突變的結(jié)果,使DNA上原有的核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列發(fā)生改變,導(dǎo)致使用限制酶去切割時(shí)得到的結(jié)果與不發(fā)生突變的結(jié)果完全不同,:某些遺傳性疾病發(fā)生特異的點(diǎn)