【正文】 、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、布魯氏菌和流感嗜血桿菌等的培養(yǎng)，特別是在初次分離時，須在5%~10 %二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)才能生長。 （1）二氧化碳培養(yǎng)箱法：二氧化碳孵箱能自動調(diào)節(jié)二氧化碳的含量、溫度和濕度，培養(yǎng)物置于孵育箱內(nèi)閣，孵育一定時間后可直接觀察生長結(jié)果。因缸內(nèi)蠟燭燃燒氧逐漸減少，數(shù)分鐘后蠟燭自行熄滅，此時容器內(nèi)二氧化碳含量約占5%~10%。 （3）氣袋法：選用無毒透明的塑料袋，將已接種標本的培養(yǎng)皿放入袋內(nèi)，盡量祛除袋內(nèi)空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。 （4）化學法：常用碳酸氫鈉鹽酸法。于35℃孵育箱內(nèi)孵育。 4．厭氧培養(yǎng) 厭氧菌對氧敏感，培養(yǎng)過程中需造成低氧化還原電勢的厭氧環(huán)境。如厭氧罐培養(yǎng)法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭氧法等。 (1)菌落的形態(tài)特征：大小、形狀（露滴狀、圓形、菜花樣、不規(guī)則等）、突起或扁平、凹陷、邊緣（光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等）、顏色（紅色、灰白色、黑色、綠色、無色、黃色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。②粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。R型細菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型細菌弱。③粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。 (2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3種情況。 (3)色素：有些細菌產(chǎn)生水溶性色素，使菌落和周圍的培養(yǎng)基出現(xiàn)綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏色，產(chǎn)生的色素有水溶性或脂溶性。 2．液體培養(yǎng)基 細菌在液體培養(yǎng)基中有3種生長現(xiàn)象：大多數(shù)細菌在液體培養(yǎng)基生長繁殖后呈均勻混濁；少數(shù)鏈狀排列的細菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長；枯草芽胞桿菌、結(jié)核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長，常形成菌膜。無鞭毛的細菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長，穿刺線兩邊的培養(yǎng)基仍然澄清透明，為動力試驗陰性。用生物化學方法測定這些代謝產(chǎn)物，可用來區(qū)別和鑒定細菌的種類。生物化學試驗的方法很多，主要有以下幾類。檢查細菌對培養(yǎng)基中所含糖（醇、苷）降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力，可用以鑒定細菌種類。所使用的糖（醇、苷）類有很多種，根據(jù)不同需要可選擇單糖、多糖或低聚糖、多元醇和環(huán)醇等，見表641。若用微量發(fā)酵管，或要求培養(yǎng)時間較長時，應注意保持其周圍的濕度，以免培養(yǎng)基干燥。不分解糖則無變化。即便是兩種細菌均可發(fā)酵同一種糖類，其發(fā)酵結(jié)果也不盡相同，如志賀菌和大腸埃希菌均可發(fā)酵葡萄糖，但前者僅產(chǎn)酸，而后者則產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，故可利用此試驗鑒別細菌。發(fā)酵型細菌無論在有氧或無氧環(huán)境中都能分解葡萄糖，而氧化型細菌在無氧環(huán)境中則不能分解葡萄糖。 (2)方法：挑取少許純培養(yǎng)物（不要從選擇性平板中挑?。┙臃N2支HL培養(yǎng)管中，（作為密封管），另一管不加（作為開放管）。 (3)結(jié)果： 兩管培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸（顏色不變）為陰性；兩管都產(chǎn)酸（變黃）為發(fā)酵型；加液體石蠟管不產(chǎn)酸，不加液體石蠟管產(chǎn)酸為氧化型。腸桿菌科、弧菌科細菌為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型。 3．甲基紅（MR）試驗 (1)原理：某些細菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等，加入甲基紅指示劑呈紅色。 (2)方法：將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育48h~96h后，于5ml培養(yǎng)基中滴加5~6滴甲基紅指示劑，立即觀察結(jié)果。 (4)應用：常用于腸桿菌科內(nèi)某些種屬的鑒別，如大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。 4．β－半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗） (1)原理：乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。 (3)結(jié)果：呈現(xiàn)亮黃色為陽性，無色為陰性。埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為試驗陽性，而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。某些細菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步脫羧形成乙酰甲基甲醇。即VP試驗陽性。 (3)結(jié)果：紅色者為陽性，黃色或類似銅色為陰性。本試驗常與MR試驗一起使用，一般情況下，前者為陽性的細菌，后者常為陰性，反之亦然。 6．膽汁七葉苷水解試驗 （1）原理：在10%~40％膽汁存在下，測定細菌水解七葉苷的能力。 (2)方法：將被檢菌接種于膽汁七葉苷培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h后，觀察結(jié)果。 (4)應用：主要用于鑒別D群鏈球菌與其它鏈球菌的區(qū)別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌（如脆弱擬桿菌等）的初步鑒別。 7．淀粉水解試驗 (1)原理：產(chǎn)生淀粉酶的細菌能將淀粉水解為糖類，在培養(yǎng)基上滴加碘液時，可在菌落周圍出現(xiàn)透明區(qū)。 (3)結(jié)果：陽性反應，菌落周圍有無色透明區(qū)，其它地方藍色；陰性反應，培養(yǎng)基全部為藍色。 8．甘油復紅試驗 (1)原理：甘油可被細菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脫去羧基為乙醛，乙醛與無色的復紅生成醌式化合物，呈深紫紅色。應同時做陰性對照。 (4)應用：主要用于沙門菌屬內(nèi)各菌種間的鑒別。 9．葡萄糖酸氧化試驗 　　(1)原理：某些細菌可氧化葡萄糖酸鉀，生成α酮基葡萄糖酸。 (2)方法：將待檢菌接種于葡萄糖酸鹽培養(yǎng)基中(1ml)，置35℃孵育48h,加入班氏試劑1ml，于水浴中煮沸10min并迅速冷卻，觀察結(jié)果。不變或仍為藍色為陰性。 二、氨基酸和蛋白質(zhì)的代謝試驗 1．硫化氫試驗 (1)原理：某些細菌能分解含硫氨基酸生成硫化氫，與亞鐵離子或鉛離子結(jié)合形成黑色沉淀物?；蛴么姿徙U紙 條，懸掛于KIA管中（白色濾紙，根據(jù)試管大小裁剪適當，在熱的50g/L醋酸鉛飽和水溶液中浸泡，然后于50~60℃烘干，121℃15min高壓滅菌備用）。 (3)結(jié)果：有黑色沉淀物為陽性。但沙門菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株，如甲型副傷寒、仙臺、豬霍亂沙門菌等。 (2)方法：將待檢菌接種于明膠培養(yǎng)基中，35℃孵育24h到7d或更長時間，每24h取出放入4℃冰箱約2h后，觀察有無凝固。如凝固，則繼續(xù)培養(yǎng)。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。 3．吲哚試驗（靛基質(zhì)試驗） (1)原理：某些細菌有色氨酸酶，能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，吲哚與對二甲氨基苯甲醛形成紅色的玫瑰吲哚。 (3)結(jié)果：紅色為陽性，無色為陰性。 4．苯丙氨酸脫氨酶試驗 (1)原理：測定細菌是否產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶。若延長時間，會引起退色。 (3)結(jié)果：有綠色出現(xiàn)為陽性。 5．氨基酸脫羧酶試驗 (1)原理：某些細菌可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶使氨基酸脫羧生成胺和二氧化碳。 (2)方法：將待檢菌分別接種于1支氨基酸（賴氨酸，鳥氨酸或精氨酸）脫羧酶試驗管和1支氨基酸脫羧酶對照管（無氨基酸）， 的無菌石蠟油，35℃孵育1~4d，觀察結(jié)果。 (4)應用：主要用于某些細菌種間的鑒別，如賴氨酸用于產(chǎn)氣腸桿菌（陽性）與陰溝腸桿菌（陰性）；鳥氨酸用于陰溝腸桿菌（陽性）和克雷伯菌（陰性）；精氨酸用于陰溝腸桿菌（陽性）和產(chǎn)氣腸桿菌（陰性）等。鳥氨酸又在脫羧酶的作用下生成腐胺。 (2) 方法：將待檢菌接種于試驗培養(yǎng)上，置35℃孵箱孵育1~4d，觀察結(jié)果。黃色為陰性。 7．尿素酶試驗 (1)原理：某些細菌能產(chǎn)生尿素酶，分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基變堿。 (3)結(jié)果：紅色為陽性，不變?yōu)殛幮浴?8．霍亂紅試驗 (1)原理：霍亂弧菌分解色氨酸生成吲哚，并能使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，當加入硫酸后生成亞硝酸吲哚，呈紅色反應。 (3)結(jié)果：呈紅色者為陽性。凡能產(chǎn)生吲哚并還原硝酸鹽為亞硝酸鹽的細菌，均可呈現(xiàn)陽性反應。 (2)方法：將待檢菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上，置35℃孵育1~4d，逐日觀察結(jié)果。 (4)應用：可用此試驗作細菌種屬間鑒定。此外，銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌和嗜水氣單胞菌也能利用枸櫞酸鹽。 (2)方法：將待檢菌接種于丙二酸鹽培養(yǎng)基中，置35℃孵育24~48h，觀察結(jié)果。顏色無變化為陰性。 3．醋酸鈉利用試驗 (1)原理：細菌利用銨鹽作為唯一氮源，同時，利用醋酸鹽作為唯一碳源時，可在醋酸鹽培養(yǎng)上生長，分解醋酸鹽生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。 (3)結(jié)果：培養(yǎng)基上有細菌生長，并變?yōu)樗{色為陽性。 4．馬尿酸鈉水解試驗 (1)原理：某些細菌可具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸與三氯化鐵試劑結(jié)合，形成苯甲酸鐵沉淀。 (3)結(jié)果：出現(xiàn)恒定之沉淀物為陽性。 乙酰胺利用試驗 (1)原理：許多非發(fā)酵菌產(chǎn)生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經(jīng)脫酰胺作用釋放氨，使培養(yǎng)基變堿。 (3)結(jié)果：培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色為陽性。 (4)應用：主要用于非發(fā)酵菌的鑒定。 四、酶類試驗 (1)原理：氧化酶又稱細胞色素氧化酶，是細胞色素氧化酶系統(tǒng)中的最終呼吸酶。因此，本試驗結(jié)果與細胞色素C的存在有關(guān)。也可將試劑滴加到菌落上進行試驗。無色為陰性。此外，也用于假單胞菌屬與腸桿菌科細菌的區(qū)別，前者陽性，而后者陰性。 注意事項： ①試驗時應避免接觸含鐵物質(zhì)，以免出現(xiàn)假陽性。 2．觸酶試驗 (1)原理：觸酶又稱過氧化氫酶，具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫成為水和原子態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。 (3)結(jié)果：若立即出現(xiàn)大量氣泡為陽性。 (4)應用：大多需氧和兼性厭氧菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故常用此試驗來鑒定。分枝桿菌的鑒別則用耐熱觸酶試驗，結(jié)核分枝桿菌為陰性，戈氏分枝桿菌和地分枝桿菌為陽性。②不宜用血瓊脂平板上生長的菌落，因紅細胞含有觸酶，可致假陽性反應，③取對數(shù)生長期的細菌。致病性葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶，一種是與細胞壁結(jié)合的凝聚因子，稱結(jié)合凝固酶，它直接作用于血漿中纖維蛋白原，使發(fā)生沉淀，包圍于細菌外面而凝聚成塊，玻片法陽性結(jié)果是由此凝聚因子所致；另一種凝固酶是分泌至菌體外，稱為游離凝固酶，它能使凝血酶原變成凝血酶類產(chǎn)物，使纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，從而使血漿凝固。 (2)方法: ①玻片法：在一張潔凈玻片中央加1滴生理鹽水，用接種環(huán)取待檢培養(yǎng)物與其混合（設(shè)陽性和陰性對照）制成菌懸液，若經(jīng)10~20s內(nèi)無自凝 現(xiàn)象發(fā)生，則加入人或兔新鮮血漿1環(huán)，與菌懸液混合，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：①玻片法：5~10s內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性。2h后無上述現(xiàn)象出現(xiàn)，則放置過夜后再觀察。 注意事項：①玻片法為篩選試驗，陽性、陰性均需進行試管法測定。③應使用肝素而非枸櫞酸鹽作抗凝劑抗凝的血漿。 4．DNA酶試驗 (1)原理： 某些細菌能產(chǎn)生DNA酶，水解外源性DNA使之成為寡核苷酸。故在DNA瓊脂平板上加鹽酸后，可在 菌落周圍形成透明區(qū)。 (3)結(jié)果：如菌落周圍有透明區(qū)者為陽性，無透明區(qū)為陰性。沙雷菌、變形桿菌和金黃色葡萄球菌DNA酶均陽性。另一方面可能與激活細菌體內(nèi)的自溶酶有關(guān)。 100g/L去氧膽酸鈉為試驗 管。②平板法：在血平板上選取單個可疑菌落，作好標記，直接在菌落上加1接種環(huán)20g/L去氧膽酸鈉（），置35℃孵育30min（平板不要翻轉(zhuǎn)）觀察結(jié)果。②平板法：如菌落消失，僅留下溶血區(qū)為陽性，菌落不消失為陰性。 6．硝酸鹽還原試驗 (1)原理：硝酸鹽還原反應包括兩個過程，其一是在合成代謝過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細胞內(nèi)其它含氮化合物；另一是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。有的細菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌等；有的細菌可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如沙雷菌屬；有的細菌還可以將其還原產(chǎn)物在合成性代謝中完全利用。某些細菌能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者與α萘胺結(jié)合生成Nα萘胺偶苯磺酸。將甲、乙等量混合液（用時混合），立即或10min內(nèi)觀察結(jié)果。如欲觀察有無氮氣產(chǎn)生，可于培養(yǎng)基管內(nèi)加1只小倒管，有氣泡產(chǎn)生，則表示有氮氣生成。 (4)應用：本試驗廣泛用于細菌鑒定。 7．卵磷脂酶試驗 (1)原理：細菌產(chǎn)生的卵磷脂酶，經(jīng)鈣離子作用，能迅速分解卵黃或血清中的卵磷脂形成混濁沉淀狀的甘油酯和水溶性磷酸膽堿。 (3)結(jié)果：3h后在菌落周圍形成乳白色混濁，即為卵磷脂酶試驗陽性，6h后該混濁圈可擴大到直徑5~6mm。產(chǎn)氣莢膜梭菌和諾維梭菌為陽性，其他梭菌為陰性。 8．磷酸酶試驗 (1)原理：磷酸酶是磷酸脂的水解酶，可使單磷脂水解，其反應可根據(jù)反應基質(zhì)不同而異，如用磷酸酚酞為基質(zhì)，經(jīng)磷酸酶水解后可釋放酚酞，在堿性環(huán)境中呈紅色。亦可用液體培養(yǎng)基，經(jīng)孵育后，向管內(nèi)加400g/L氫氧化鈉溶液1滴，觀察結(jié)果。 (4)應用：主要用于致病性葡萄球菌與非致病性葡萄球菌的鑒別，前者為陽性，后者為陰性。在培養(yǎng)基中加入維多利亞藍可與脂肪結(jié)合成為無色化合物，如果脂肪被分解，則維多利亞藍釋出，呈藍色。 (3)結(jié)果：培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{色者為陽性，否則可呈無色或粉紅色。在擬桿菌中產(chǎn)黑色素擬桿菌中間亞種產(chǎn)生脂酶，其它擬桿菌陰性；在梭菌屬中諾維梭菌和產(chǎn)芽胞梭菌也產(chǎn)生此酶，其它梭菌為陰性。因此，可在兩種細菌的交界處溶血力增強，出現(xiàn)箭頭型透明溶血區(qū)。再將待檢菌與前一劃線作垂直接種，兩者應相距1cm，于35℃孵育18~24h，觀察結(jié)果。 (3)結(jié)果：兩種細菌劃線交接處出現(xiàn)箭頭型溶血區(qū)為陽性。 11．石蕊牛乳試驗 (1)原理：由于牛乳內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)和糖類，各種細菌對這些物質(zhì)的分解能力不同，故可有數(shù)種不同反應，用以鑒別細菌。觀察結(jié)果。②產(chǎn)氣：發(fā)酵乳糖而同時產(chǎn)氣，可沖開上面的凡士林。④胨化：將凝固的酪蛋白繼續(xù)水解為胨，培養(yǎng)基上層液體變清，底部可留有未被完全胨化的酪蛋白。 (4)應用：主要用于梭菌、鏈球菌和丙酸桿菌的鑒定。對肺炎鏈球菌有特異抑制作用，其作用機制可能是干擾葉酸生物合成作用，而對其它鏈球菌則無此作用。 (3)結(jié)果：抑菌圈直徑大于14mm為敏感，小于或等于 14mm為陰性。 2．桿菌肽敏感試驗 (1)原理：A群鏈球菌對桿菌肽幾乎是100%敏感，而其它群鏈球菌對桿菌肽通常耐藥。 (2)方法：用棉拭子將待檢菌的肉湯培養(yǎng)物均勻涂布于血瓊脂平板上，置35℃ 孵育18~2