【正文】 用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng) 。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 選擇培養(yǎng)基分離 ? 選擇培養(yǎng)基特性 ?促生長(zhǎng)能力 ?抑制能力 ?指示（鑒別）能力 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 選擇培養(yǎng)基分離 ? 傳統(tǒng) 選擇性培養(yǎng)基 ? 血平板： 適于各類(lèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)，一般細(xì)菌檢驗(yàn)標(biāo)本的分離，都應(yīng)接種此平板。 ? 中國(guó)藍(lán)平板或伊紅美藍(lán)平板： 可抑制 G+細(xì)菌，有選擇地促進(jìn)G菌生長(zhǎng)，是較好的弱選擇性培養(yǎng)基。 ? SS瓊脂： 有較強(qiáng)的抑菌力，用于志賀菌和沙門(mén)菌的分離。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 選擇培養(yǎng)基分離 ? 新型 顯色培養(yǎng)基 ? 利用微生物自身代謝產(chǎn)生的 酶與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)顯色 的原理來(lái)檢測(cè)微生物的培養(yǎng)基。 形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞特征 培養(yǎng)特征 生理生化試驗(yàn) 生長(zhǎng)溫度 耐鹽性 碳源利用 發(fā)酵產(chǎn)酸 其他 化學(xué)成分分析 呼吸醌 極性脂 脂肪酸 分枝菌酸 氨基酸和糖 其他 基因型分析 核酸序列 分析 功能基因 分析 DNA雜交 指紋圖譜、 菌株分型 其他 系統(tǒng)發(fā)育分析 16S rDNA ITS區(qū) 26S D1/D2區(qū) 其他 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)菌 酵母 絲狀真菌 宏觀 形態(tài)（培養(yǎng)特征） 將培養(yǎng)物劃線(xiàn)或稀釋涂布， 30℃ 培養(yǎng) 16~24小時(shí)，選取劃線(xiàn)或稀釋涂布分離得到單菌落，觀察和記錄菌落的形狀、大小、質(zhì)地、邊緣、顏色、光澤、透明度、隆起等 。 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基 （ CA、 CYA、 WA）平板倒轉(zhuǎn)，向上接種三點(diǎn)，每個(gè)菌株接種兩個(gè)平板，倒置于 25℃溫箱中進(jìn)行培養(yǎng) 7天。 微觀 形態(tài)（細(xì)胞特征） 將培養(yǎng)物在 30℃ 條件下培養(yǎng) 16~24小時(shí)，挑取對(duì)數(shù)期的單菌落，涂布于事先滴加少量無(wú)菌水的載玻片上，自然干燥，加熱固定，進(jìn)行革蘭氏染色，將制好的染色涂片在 100X40倍的顯微鏡下觀察革蘭氏染色情況、菌體形狀、排列行狀、菌體大小 等細(xì)胞特征。 用無(wú)菌接種針挑取少量培養(yǎng)物，浸入滴有一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液的載玻片上，用接種針將菌絲團(tuán)分散開(kāi)，蓋上蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡），制成水浸片，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征，包括分生孢子梗、分生孢梗莖、頂囊、梗基、瓶梗、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子頭、分生孢子等 。 ? 六類(lèi)鑒定試驗(yàn)板，可鑒定 500種細(xì)菌 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 化學(xué)成分分析 ? 細(xì)胞質(zhì)膜： 呼吸醌 （甲基萘醌和泛醌） ? 細(xì)胞質(zhì)膜： 極性脂 ? 細(xì)胞質(zhì)膜： 脂肪酸 除放線(xiàn)菌外的細(xì)菌 ? 外膜： 分枝菌酸 ? 細(xì)胞壁： 肽聚糖 （氨基酸和糖） ? 全細(xì)胞： 糖和蛋白質(zhì) 放線(xiàn)菌 m i n2 . 5 5 7 . 5 10 1 2 . 5 15 1 7 . 5 20pA131415161718 F I D 1 A , ( E 1 2 6 1 9 . 6 0 2 \ A 0 0 4 1 0 8 0 . D ) 1.748 2.032 2.110 3.638 4.066 7.066 8.578 8.720 10.226 10.851 11.529 11.696 11.952 12.116醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 基因型分析 ? G+Cmol% ? 16S rDNA, 26S rDNA D1/D2, rDNA ITS region, ? βtubulin gene, calmodulin gene, gyrA gene, pheS gene, recN gene, rpoB gene and other housekeeping genes. ? DNA Barcoding gene sequence analysis, MultiLocus Sequence Analysis (MLSA) ? DNADNA hybridization ? RAPD, RFLP, AFLP, SSCP, EricPCR, BOXPCR, RepPCR , LAMP. 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 基因型分析 DNA 指紋圖譜分析 1 2 3 4 EricPCR BOXPCR RepPCR SSCP ERIC－ PCR 以細(xì)菌 DNA中串聯(lián)重復(fù)序列為引物， 通過(guò)擴(kuò)增細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列，在不同種屬個(gè)體間表現(xiàn)為在染色體上存在的位置和拷貝數(shù)不同，以電泳條帶比較分析，揭示基因組間的差異，應(yīng)用于菌株分型。 REP PCR 擴(kuò)增細(xì)菌基因的重復(fù) DNA 片段來(lái)獲得菌株特異性遺傳圖譜 , 其中重復(fù) DN A 片段包含了一個(gè)高度保守的回文序列 (REP)為 38 bp 的片段 , 由 1個(gè)保守回文段以及兩端分別有 6 個(gè)降解位點(diǎn)和 1 個(gè) 5 bp 的可變框構(gòu)成。 假絲酵母 PCRSSCP 副溶血弧菌 ERIC－ PCR 沙門(mén)氏菌 REP PCR 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 1 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) infB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 2022年 Aspergillus brasiliensis 2022年 ATCC 16404 鑒定為 Aspergillus brasiliensis . 2022年 USP 將 ATCC 16404 更名 2022年 WDCM 將 ATCC 16404 更名 圖： ATCC 16888和 ATCC 16404的培養(yǎng)特征和顯微形態(tài) a180。ndor Kocsube180。 ta To180。 16404TM and ATCC174。 16404TM and ATCC174。 ?各類(lèi) 標(biāo)準(zhǔn)中，其它被指定為參考菌株的黑曲霉菌株 (CMCC(F) 98003) ,需要重新復(fù)核鑒定 。 C培養(yǎng) 7 d ? Biolog鑒定 ? 生長(zhǎng)濁度試驗(yàn) ? ITS rDNA區(qū)序列 分析 ? ITS4: 5?TCCTCCGCTTATTGATATGC3? ? ITS5: 5?GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3? ? β微管蛋白基因序列 分析 ? Bt2a: 5?GGTAACCAAATCG GTGCTGCTTTC3? ? Bt2b: 5?ACCCTCAGTGTAGT GACCCTTGGC3? 反應(yīng)體系： 100 μL, 10 擴(kuò)增緩沖液 10 μL。 dNTP (每種 mmol/L) 8 μL。 Taq DNA聚合酶 ( U/μL) μL。 反應(yīng)程序： 94176。 94176。 C 1 min, 72176。 72176。 C保存 。 C培養(yǎng) 7 d菌種的宏觀形態(tài)和顯微形態(tài) Fig Macromorphology and micromorphology on 25176。 B: 分生孢子梗形態(tài) ( 100)。 C: Conidial morphology ( 400). 該菌株的形態(tài)學(xué)特征符合黑曲霉 A. niger的形態(tài)特征 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? Biolog鑒定 注 : ?: 沒(méi)有生長(zhǎng) 。 w: 微弱 (邊界 )生長(zhǎng) 。 +: Strong growth。 v: Varied growth. 表 碳源利用情況 Table Carbon Source Utilization 碳源 Carbon source ATCC16888 Aspergillus niger ATCC16404 Aspergillus brasiliensis CMCC(F)98003 麥芽糖 Maltose + ? + β甲基 D葡萄糖苷 βMethylDGlucoside + ? + D海藻糖 DTrehalose + ? + L蘋(píng)果酸 LMalic Acid v + ? α酮戊二酸 αKetoglutaric acid ? w ? 苦杏仁苷 Amygdalin + ? + D果糖 DFructose + v + 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? ITS rDNA區(qū)序列 分析 圖 CMCC(F)98003的 ITS rDNA區(qū)序列和 β 微管蛋白基因序列 PCR擴(kuò)增結(jié)果 Fig ITS rDNA and