【正文】 min內(nèi)達(dá)到 ， 隨后逐漸達(dá)到 ～ ， 在此條件下 ， 樣品將保持凍結(jié)狀態(tài) ， 其中水分則不斷升華 ， 干燥才能順利地進(jìn)行 。 ? 終止干燥時(shí)間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷 ： ? 安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀 ? 真空度接近空載時(shí)的最高值 ? 樣品溫度與管外溫度接近 ? 選用 1～ 2支對(duì)照管 ， 其水份與菌懸液同量 ， 當(dāng)其水分完全蒸發(fā)時(shí)視為干燥完結(jié) 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 預(yù)凍 ? 制備菌懸液、經(jīng)分裝到進(jìn)行預(yù)凍之間的時(shí)間不宜超過(guò) 1h； ? 分裝完成后將安瓿管立刻放入－ 35～－ 40℃ 冰箱預(yù)凍 1h，使菌液完全凍結(jié)； ? 可采用分段式預(yù)凍，先將分裝好的安瓿管置－ 20℃ 凍 30分鐘，再放入－ 80℃ 冰箱凍 30min； ? 采用離心式凍干裝置時(shí)勿需預(yù)凍。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 熔封 ? 將安瓿管的中上部用火焰燒軟 ， 拉成細(xì)頸； ? 將安瓿管裝到多歧管上 ， 用火焰在細(xì)頸處熔封； ? 拉管時(shí)注意火焰不要離菌體太近 。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 真空度檢測(cè) 用高頻電火花檢查各安瓿管的真空情況，如管內(nèi)呈現(xiàn)灰藍(lán) 光，說(shuō)明真空度符合要求。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 保藏 4～ 6℃ 下避光保藏， 一般可保藏 8～ 10年。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 真空冷凍干燥法 ? 保藏、運(yùn)輸方便； ? 保藏時(shí)間長(zhǎng) (5 ～ 10年 )； ? 對(duì)設(shè)備要求高 (真空冷凍干燥機(jī)、多歧管 )，對(duì)人員操作水平要求高； ? 冷凍干燥過(guò)程對(duì)菌體有損傷，需恢復(fù)培養(yǎng)。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 80℃ 冰箱凍結(jié)法 ? 將菌種懸浮于保護(hù)劑中，在－ 80℃ 冰箱中凍結(jié)保存的一種長(zhǎng)期菌種保藏方法。 準(zhǔn)備冷凍管 準(zhǔn)備保護(hù)劑 （ 10%15%甘油） 準(zhǔn)備菌懸液（細(xì)胞、孢子或芽孢懸液） 制備冷凍管（取菌懸液和保護(hù)劑至冷凍管） 保藏（ 80℃ ， 2～ 5年） 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 Microbank 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 80℃ 冰箱凍結(jié)法 ? 使用方便； ? 保藏時(shí)間較長(zhǎng)； ? 對(duì)設(shè)備要求高 (80℃ 冰箱 )； ? 運(yùn)輸不方便。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 液氮超低溫凍結(jié)法 ? 指懸浮于保護(hù)劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移置于－ 196℃的液氮或－ 150℃ 左右的液氮?dú)庀嘀斜４娴囊环N長(zhǎng)期菌種保藏方法。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 操作步驟 ? 冷凍管準(zhǔn)備 ? 保護(hù)劑制備 ? 保藏培養(yǎng)物準(zhǔn)備 ? 預(yù)凍 — 將程序降溫系統(tǒng)預(yù)冷到 4℃ ，將制備好的冷凍管放入其中，以 1℃ /min降溫速率降至 35℃ ； — 使用程序降溫盒。 ? 保藏 將預(yù)凍后的冷凍管轉(zhuǎn)移至液氮?dú)庀?(150℃ )或液相 (196℃ )。 同“－ 80℃ 冰箱凍結(jié)法” 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 液氮超低溫凍結(jié)法 ? 保藏時(shí)間長(zhǎng)； ? 保藏效果好，菌種不易退化； ? 對(duì)設(shè)備要求高 (程控降溫儀、液氮罐 )，對(duì)人員操作水平要求高； ? 保藏成本高。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 不同保藏方法的比較 保藏方法 保藏原理 保藏時(shí)間 保藏設(shè)備 菌種活性 保藏成本 操作性 定期移植法 低溫 (4 ℃ ) 3 ～ 6 月 冰箱 易退化 高 簡(jiǎn)單 液體石蠟法 低溫 (4 ℃ ) 、阻斷氧氣 1 ～ 2 年 冰箱 退化 較高 比較簡(jiǎn)單 真空冷凍干燥法 干燥、低溫、無(wú)氧、保護(hù)劑 8 ～ 10 年 － 80 ℃冰箱、真空冷凍干燥機(jī)、封管設(shè)備 退化 低 復(fù)雜 － 80 ℃冰箱凍結(jié)法 低溫 ( － 80 ℃ ) 、保護(hù)劑 2 ～ 5 年 － 80 ℃冰箱 退化 較低 復(fù)雜 液氮超低溫凍結(jié)法 超低溫 ( － 150 ℃或－ 1 9 6℃ ) 、保護(hù)劑 10 年 以上 程控降溫儀、 液氮運(yùn)輸罐及液氮罐 不易退化 高 復(fù)雜 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 六、質(zhì)控微生物 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 保藏菌株要求 ?藥品微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的 國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種收藏機(jī)構(gòu) 的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的 商業(yè)派生菌株 。 92 2022版中國(guó)藥典 《 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則 》 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 國(guó)內(nèi)認(rèn)可的菌種收藏機(jī)構(gòu) ? 1979年 7月，全國(guó)第一屆菌種保藏管理會(huì)議正式成立中國(guó)菌種保藏管理委員會(huì)（ CCCCM），委員會(huì)下設(shè) 7個(gè)全國(guó)性菌種保藏管理中心及機(jī)構(gòu)所在地： ? 普通微生物菌種保藏管理中心（ CCGMC） , 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 ? 農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ ACCC） ,中國(guó)農(nóng)科院區(qū)劃所 ? 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ CICC），中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 ? 醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（ CMCC），中國(guó)藥品生物制品鑒定所 ? 抗菌素菌種保藏管理中心（ CACC），中國(guó)醫(yī)科院醫(yī)用生物技術(shù)研究所 ? 獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（ CVCC），農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ? 林業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ CFCC），中國(guó)林業(yè)科學(xué)院 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 國(guó)認(rèn)外可的菌種收藏機(jī)構(gòu) ? 世界菌種保藏聯(lián)合會(huì) WFCC (World Federation Of Culture Collection)全球注冊(cè)的菌種保藏機(jī)構(gòu) 583家 ? ATCC ? NRRL ? DSMZ ? NCTC ? CMI ? CBS ? NBRC(IFO) ? JCM 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 菌株代數(shù) 美國(guó)藥典（ USP）中規(guī)定： “ 將微生物接種至一新鮮培養(yǎng)基上 /內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代， ” 并規(guī)定 “ 菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過(guò) 5代 ” 。 United States Pharmacopoeia (USP) provides that: to microbial inoculation to a fresh medium on / in each germination time is referred to as a generation, and provides that strains of the passages (from the original strain from freezedried powder) must not exceed 5 generation. ― 我國(guó)的 GMP認(rèn)證中也如此要求，并且中國(guó)藥典 2022年版藥典也已做出 “ 菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過(guò) 5代 ” 這個(gè)明確的規(guī)定。 China39。s GMP certification is asking, and the Chinese Pharmacopoeia 2022 edition of Pharmacopoeia also had a strain of the passages (from the original strain from freezedried powder) should not exceed 5 on behalf of The clearly defined. Enrichment (G1) Separation of singleolony(G2) Working strain (W3) Working strain (W4) Working strain (W5) 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 標(biāo)準(zhǔn)菌株提供形式 Accuracy Easy of Use (preparation) High Low Complicated Easy Quanti Cult (REMEL) Standard Strains (ATCC/NBRC etc.) EZCFU one step (MicroBioLogics) KWIKSTIK (MicroBioLogics) Culti Loops (REMEL) BioBall (BTF/bioMerieux) 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 質(zhì)控菌株 Primary strain Qualitative strain Quantitative strain 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 視頻材料 ? 質(zhì)控菌株的使用 質(zhì)控菌株