【文章內(nèi)容簡介】 和 boxC(50 bp)等亞單位組成 )設計引物 , 擴增微生物基因組 DNA 的重復性片段 , 最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其多態(tài)性 。 REP PCR 擴增細菌基因的重復 DNA 片段來獲得菌株特異性遺傳圖譜 , 其中重復 DN A 片段包含了一個高度保守的回文序列 (REP)為 38 bp 的片段 , 由 1個保守回文段以及兩端分別有 6 個降解位點和 1 個 5 bp 的可變框構成。 PCRSSCP是聚合酶鏈式反應與單鏈 DNA 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術結合 ， 利用不同構象單鏈 DNA 在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中泳動速率的差異 , 檢測出 DNA短片段中存在的單核苷酸突變 ,現(xiàn)已廣泛應用于各種基因多態(tài)性的研究 。 假絲酵母 PCRSSCP 副溶血弧菌 ERIC－ PCR 沙門氏菌 REP PCR 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 鑒定實例 1 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹 infB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 2022年 Aspergillus brasiliensis 2022年 ATCC 16404 鑒定為 Aspergillus brasiliensis . 2022年 USP 將 ATCC 16404 更名 2022年 WDCM 將 ATCC 16404 更名 圖： ATCC 16888和 ATCC 16404的培養(yǎng)特征和顯微形態(tài) a180。nos Varga, Sa180。ndor Kocsube180。 , Bea180。 ta To180。 th, et al. Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with worldwide distribution. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2022, 57: 1925–1932 圖 : RepPCR條碼系統(tǒng)發(fā)育樹 (DiversiLab平臺 ) Figure 2: Dendrogram of RepPCR Barcoding (DiversiLab Platform) . 注：圖片來源于 Reclassification of ATCC174。 16404TM and ATCC174。 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2022, Vol. 14 (10): 214 表 ITS序列特殊位點堿基差異 Table Difference of base position in ITS sequence 四、微生物鑒定 鑒定實例 2 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 2022年 Aspergillus brasiliensis 2022年 ATCC 16404 鑒定為 Aspergillus brasiliensis . 2022年 USP 將 ATCC 16404 更名 2022年 WDCM 將 ATCC 16404 更名 圖 : 基于曲霉黑色組 β微管蛋白基因序列的 NJ樹 Figure : Neighbour –joining tree based on βtubulin sequence data of Aspergillus section Nigri.. 注：圖片來源于 Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with worldwide distribution International. Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2022, 57: 1925–1932 圖 1: 基于 ITS DNA序列的黑色曲霉 NJ樹 Figure 1: A Neighbor Joining Tree of Black Aspergilli based on Their ITS DNA Sequences. 注：圖片來源于 Reclassification of ATCC174。 16404TM and ATCC174。 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2022, Vol. 14 (10): 214 四、微生物鑒定 鑒定實例 2 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ?各種標準中仍將繼續(xù)采用 ATCC 16404作為質控菌株 。 ?各類 標準中，其它被指定為參考菌株的黑曲霉菌株 (CMCC(F) 98003) ,需要重新復核鑒定 。 巴西曲霉 (Aspergillus brasiliensis） 黑曲霉 (Aspergillus niger) 黑曲霉 四、微生物鑒定 鑒定實例 2 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? 形態(tài)學鑒定 ? CYA培養(yǎng)基 , 25176。 C培養(yǎng) 7 d ? Biolog鑒定 ? 生長濁度試驗 ? ITS rDNA區(qū)序列 分析 ? ITS4: 5?TCCTCCGCTTATTGATATGC3? ? ITS5: 5?GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3? ? β微管蛋白基因序列 分析 ? Bt2a: 5?GGTAACCAAATCG GTGCTGCTTTC3? ? Bt2b: 5?ACCCTCAGTGTAGT GACCCTTGGC3? 反應體系： 100 μL, 10 擴增緩沖液 10 μL。 DNA模板 1 μL 。 dNTP (每種 mmol/L) 8 μL。 引物 (10 μL/L)各 μL。 Taq DNA聚合酶 ( U/μL) μL。 無菌超純水補足總體積 100 μL。 反應程序： 94176。 C 5 min。 94176。 C 1 min, 55176。 C 1 min, 72176。 C 1 min, 30個循環(huán) 。 72176。 C 10 min, 4176。 C保存 。 四、微生物鑒定 鑒定實例 2 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? 形態(tài)學鑒定 圖 25176。 C培養(yǎng) 7 d菌種的宏觀形態(tài)和顯微形態(tài) Fig Macromorphology and micromorphology on 25176。 C, 7 d 注 : A菌落形態(tài) 。 B: 分生孢子梗形態(tài) ( 100)。 C: 分生孢子形態(tài) ( 400). Note: A: Colony morphology, B: Conidiophore morphology ( 100)。 C: Conidial morphology ( 400). 該菌株的形態(tài)學特征符合黑曲霉 A. niger的形態(tài)特征 四、微生物鑒定 鑒定實例 2 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? Biolog鑒定 注 : ?: 沒有生長 。 +: 生長旺盛 。 w: 微弱 (邊界 )生長 。 v: 可變 . Note: ?: No growth。 +: Strong growth。 w: Weak growth。 v: Varied growth. 表 碳源利用情況 Table Carbon Source Utilization 碳源 Carbon source ATCC16888 Aspergillus niger ATCC16404 Aspergillus brasiliensis CMCC(F)98003 麥芽糖 Maltose + ? + β甲基 D葡萄糖苷 βMethylDGlucoside + ? + D海藻糖 DTrehalose + ? + L蘋果酸 LMalic Acid v + ? α酮戊二酸 αKetoglutaric acid ? w ? 苦杏仁苷 Amygdalin + ? + D果糖 DFructose + v + 四、微生物鑒定 鑒定實例 2 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? ITS rDNA區(qū)序列 分析 圖 CMCC(F)98003的 ITS rDNA區(qū)序列和 β 微管蛋白基因序列 PCR擴增結果 Fig ITS rDNA and β tubulin gene PCR amplification results of CMCC(F)98003 注 : M: DL2022 marker。 1: ITS rDNA區(qū) PCR擴增結果 。 2:β 微管蛋白基因 PCR擴增結果 . Note: M: DL2022 marker。1: ITS rDNA PCR amplification result 。 2:β tubulin gene PCR