【正文】 微生物基本操作技術(shù) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 CICC 姚 粟 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 內(nèi) 容 ? 微生物分類 ? 微生物接種和培養(yǎng) ? 微生物的分離 ? 微生物的鑒定 ? 微生物保藏 ? 質(zhì)控微生物 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 一、微生物分類 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 一、微生物分類 微生物的進化和多樣性 普遍性系統(tǒng)發(fā)育樹 ,親緣關(guān)系根據(jù) rRNA序列比較來決定。 G. J. Olsen and C. R. Woese, ?Ribosomal RNA: A key to Phylogeny? in the FASEB Journal, 7:113123,1993 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 一、微生物分類 ? 原核生物 ? 大小 : mm ? 形狀 : ? 球型 (Sthaphylococcus) ? 棒狀 (Escherichia coli) ? 螺旋 (Rhodospirillum) ? 生長迅速， 20min至幾小時可繁殖一代 ? 可利用多種碳源 ? 真核生物 ? 細胞器： ? 線粒體 ? 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) ? 高爾基體 ? 液泡 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 一、微生物分類 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 原核生物 一、微生物分類 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 真核生物 一、微生物分類 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 一、微生物分類 多相分類 ? 表征（表型）特征 ? 形態(tài)特征 ? 生理和代謝特征 ?生態(tài)特征 ? 遺傳（基因型）特征 ? 蛋白質(zhì)比較 ?核酸堿基組成 ? 核酸序列 多相分類 Polyphasic Texonomy Technology 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 一、微生物分類 微生物的分類等級 ? “種 ”是微生物分類中最基本的分類單元。 ? “種” 的定義：一個種（基因型種）是有相似 G+C組成并通過DNA雜交試驗判斷由 70%或更大相似性的菌株的集合。 ? 分類等級 ?界（ Domain） ?門（ Phylum） ?綱（ Class） ?目（ Order） ?科（ Family） ?屬（ Genus） ?種（ Species） 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) ? 微生物接種定義 將微生物的純種或含菌材料（如水、食品、空氣、土壤、排泄物等）轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上，這個操作過程叫微生物的接種。 ? 接種工具 ? 微生物接種技術(shù)分類 ? 斜面接種 ? 液體接種 ? 穿刺接種 ? 平板接種 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) ? 斜面接種 ? 左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，并盡量放平； ? 右手先將棉塞（硅膠塞）擰轉(zhuǎn)松動，再拿接種環(huán)； ? 用右手的小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，同時將管口在火焰上灼燒； ? 接種環(huán)灼燒滅菌后插入試管內(nèi)，冷卻、挑菌，轉(zhuǎn)入另一斜面底部，沿斜面劃曲線或直線。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) ? 液體接種 ? 操作方法與斜面接種基本一致，只是將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中時使接種環(huán)與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散； ? 塞上棉塞，輕輕搖動均勻； ? 如果菌種培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，使用移液管或滴管接種。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 三、微生物接種和培養(yǎng) ? 穿刺接種 ? 用接種針調(diào)取菌種后，插入深層固體培養(yǎng)基內(nèi)（不要刺到底部），再沿原路拔出； ? 此法用于厭氣性細菌接種，檢查細菌的運動能力。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) ? 平板接種 ? 平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)、分離純化菌種，以及活菌計數(shù)等； ? 平板接斜面：平板分散的單菌落接于斜面； ? 斜面接平板：點種法、劃線法。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 三、微生物分離 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 微生物純培養(yǎng)分離技術(shù) ? 純培養(yǎng)物 是指來源于同一單細胞的細胞群體。 ? 獲得純培養(yǎng)物 對微生物學(xué)研究至關(guān)重要。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 微生物純培養(yǎng)分離技術(shù) ?涂布平板法 ?平板劃線法 ?平板傾注法 ?稀釋搖管法 ?液體培養(yǎng)基分離法 ?單細胞（孢子）分離法 ?選擇培養(yǎng)基分離法 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 涂布平板法 少量樣品加到平板中央（ ）； 玻璃三角涂棒浸入酒精； 沾有酒精的涂棒在火焰上灼燒后使其冷卻； 無菌涂棒將樣品均勻涂布瓊脂培養(yǎng)基表面，適當(dāng)條件下培養(yǎng)。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 涂布平板法 樣品需適當(dāng)稀釋 30300CFU/mL 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 平板劃線法 ?斜線法 ?曲線法 ?方格法 ?放射法 ?四格法 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 平板劃線法 斜線法： 用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線 34條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿 70176。 角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和第四次平行劃線。 曲線法 ： 將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 平板劃線法 血瓊脂平板上的金黃色葡萄球菌（大的金黃色菌落） 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 平板傾注法 對起始樣品進行連續(xù) 10倍稀釋，將高稀釋倍數(shù)的樣品與冷卻至適當(dāng)溫度的溶化瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿后混合均勻，培養(yǎng)后獲得單菌落。 培養(yǎng)基表面菌落為圓形，而 培養(yǎng)基內(nèi)部 菌落呈 豆狀或透鏡狀 。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 稀釋搖管法 ? 適合厭氧菌的純培養(yǎng)分離 無菌瓊脂培養(yǎng)基試管加熱 使瓊脂熔化后冷卻并保持在 50℃ 左右 梯度稀釋后的待分離菌株加入試管中 搖勻、冷凝 在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌 液體石蠟和固體石蠟的混合物 培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 液體培養(yǎng)基分離 ?不能在固體培養(yǎng)基上生長的微生物 仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。 ?稀釋法 是液體培養(yǎng)基分離純化常用的方法。 ?在同一個稀釋度的許多平行試管中， 大多數(shù)（一般應(yīng)超過 95%）表現(xiàn)為不生長。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 單細胞（孢子）分離 ? 單細胞（或單孢子）分離法是采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。 ? 較大的微生物 ，可采用毛細管提取單個個體。 ? 個體相對較小的微生物 ，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養(yǎng) 。 ? 單細胞分離法對 操作技術(shù) 有比較高的要求。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 選擇培養(yǎng)基分離 ? 選擇培養(yǎng)基特性 ?促生長能力 ?抑制能力 ?指示（鑒別）能力 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 選擇培養(yǎng)基分離 ? 傳統(tǒng) 選擇性培養(yǎng)基 ? 血平板： 適于各類細菌的生長，一般細菌檢驗標本的分離，都應(yīng)接種此平板。 ? 營養(yǎng)肉湯： 用于標本及各類細菌的增菌 ? 巧克力血平板： 其中含有 V和 X因子，適于接種疑有 嗜血桿菌、奈瑟菌 等的標本。 ? 中國藍平板或伊紅美藍平板： 可抑制 G+細菌，有選擇地促進G菌生長，是較好的弱選擇性培養(yǎng)基。