【正文】 殼聚糖納米粒子的影響因素有以下幾個(gè)：殼聚糖溶液濃度，油水比，表面活性劑用量，pH值，攪拌速率，乳化時(shí)間，交聯(lián)劑用量，交聯(lián)時(shí)間和交聯(lián)溫度等。(1)不同油相體系的選擇（1）（2）（3）（4）（5）的方法是平行的，用最佳條件做就好了~水相：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。取500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后逐漸滴加1%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。(2)不同油水比的選擇水相：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/ml的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。取500 μL CS溶液緩慢滴加到不同體積的油相溶液中，經(jīng)超聲2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后逐漸滴加1%3 ml的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。(3)不同表面活性劑用量的選擇水相：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。取500 μL CS溶液緩慢滴加到含不同量Span80的油相溶液中，經(jīng)超聲2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后逐漸滴加的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。(4)不同殼聚糖濃度的選擇水相：分別稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖250 mg, 375 mg, 500 mg, 625 mg溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成濃度分別為10 mg/mL，15 mg/mL，20 mg/mL，25 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。取500 μL 不同濃度的CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后逐漸滴加1%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。(5)不同交聯(lián)劑用量的選擇水相：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖375 mg溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成濃度為15 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。取500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲2h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后分別逐漸滴加2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL 1 %的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。取500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，%，1%，3%，5%，7%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 油相體系對(duì)殼聚糖納米粒子的影響(1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析表23 ，甲苯作為油相制備所得的納米粒子粒徑與PdI明顯比液體石蠟制得的粒子大，這可能與油相體系的粘度有關(guān)。 sizesNo.size()PdIparaffintolueneparaffintoluene1 2 3 4 油相體系對(duì)納米粒子粒徑的影響Fig. Comparison of different oil phase on nanoparticles’ size 油水比對(duì)殼聚糖納米粒子的影響(1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析。這可能是由于在油相體積較小時(shí)，水相納米粒子分散不均勻，存在納米粒子粘連現(xiàn)象，而交聯(lián)劑的加入使得這些納米粒子粘連現(xiàn)象加重，從PdI和粒徑分布圖看出，油相體積比小時(shí)PdI較大，分散不均勻。表24 油水比對(duì)納米粒子粒徑的影響Table 24Effect of the ratio of paraffin to CS on nanoparticles 39。 sizes 不同油水比納米粒子的粒徑分布Fig. Comparison of different ratio of paraffin to CS on nanoparticles39。結(jié)果與納米粒度儀測(cè)得的平均粒徑大約相符。隨著油水比的增加，粒子逐漸變小，形貌趨于規(guī)則的圓球。隨著油相體積增加，油包水乳液的油膜增厚，形成的乳滴較穩(wěn)定，且分散均勻，交聯(lián)固化后的產(chǎn)物呈圓球狀。 shapes(A1) O/W=10:1 (A2) O/W=20:1 (A3) O/W=30: 1 (A4) O/W=40:1 (A5) O/W=50:1 表面活性劑用量對(duì)殼聚糖納米粒子的影響(1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析。在體系中加入乳化劑是為了獲得穩(wěn)定的乳液。乳化劑的用量需要適中，太少(2%)可能導(dǎo)致界面層太薄，膜強(qiáng)度不夠。結(jié)果表明，控制span80的用量為油相體積的3%可以取得粒徑較小的產(chǎn)物。 sizesNo.PercentageSpan80(g)Size()PdIB12% B23% B34% B45% B56% 不同Span80對(duì)納米粒子影響對(duì)比圖Fig. Comparison of different Span80 dosage on nanoparticles39。 sizes(B1) 2% (B2) 3% (B3) 4% (B4) 5% (B5) 6%(2)TEM 分析TEM觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進(jìn)行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。從TEM圖中可觀察到，當(dāng)表面活性劑用量較少或較多時(shí)，形成的納米粒子性狀不規(guī)則，并且粒徑較大。當(dāng)乳化劑用量適中，形成的乳滴分散均勻，交聯(lián)固化后形成的納米粒子粒徑較小，且分布均勻，TEM成像時(shí)襯度足夠，故磷鎢酸染色后，仍呈黑色圓球。 不同Span80用量納米粒子的TEM圖Fig. TEM images of nanoparticles39。由表24與圖28可見(jiàn)，當(dāng)殼聚糖溶液濃度為10 mg/ml時(shí)，產(chǎn)物的粒徑達(dá)到了微米級(jí)。當(dāng)殼聚糖濃度為15 mg/mL時(shí)，產(chǎn)物的粒徑最小，分布性最好。這可能是由于殼聚糖濃度增加，粘度也隨著增加，殼聚糖間互相粘連使得乳化時(shí)分子較大，最終造成交聯(lián)得到的粒子粒徑也變大。 sizesNo.CS(mg/ml)size()PdIC110 C215 C320 C425 殼聚糖濃度對(duì)納米粒子粒徑的影響Fig. Comparison of different CS concentration on nanoparticles39。 sizes(C1) 10 mg/mL (C2) 15 mg/mL (C3) 20 mg/mL (C4) 25 mg/mL(2) TEM 分析TEM觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進(jìn)行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。從TEM圖中可觀察到，殼聚糖溶液濃度過(guò)小或過(guò)大，得到的產(chǎn)物粒徑均比較大。殼聚糖濃度較大，納米粒子間粘連現(xiàn)象嚴(yán)重，造成產(chǎn)物粒徑大。 不同殼聚糖濃度納米粒子TEM圖Fig. TEM images of nanoparticles39。這可能是由于選擇的交聯(lián)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)適中，在體積較小時(shí)已經(jīng)能夠與殼聚糖交聯(lián)固化，當(dāng)體積增加時(shí)，多余的交聯(lián)劑不參加交聯(lián)。①同交聯(lián)劑體積表27 交聯(lián)劑(1 %)體積對(duì)納米粒子粒徑的影響Table 27Effect of G dosage on nanoparticles39。 sizes②不同交聯(lián)劑濃度，殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯(lián)劑的濃度有關(guān)。當(dāng)交聯(lián)劑濃度較低時(shí)，交聯(lián)程度小，交聯(lián)效果差。但濃度太大，導(dǎo)致局部濃度過(guò)大而使得局部液滴間也進(jìn)行交聯(lián)，造成粒徑分布不均勻，且粒徑增加。 sizesNo.Glutaraldehyde aqSize()PdIE1% E21% E33% E45% E57% 不同交聯(lián)劑濃度對(duì)納米粒子粒徑的影響Fig. Comparison of different glutaraldehyde concentration on nanoparticles39。 sizes(E1) % (E2) 1% (E3) 3% (E4) 5% (E5) 7% (2)TEM 分析TEM觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。從TEM圖中可觀察到，當(dāng)交聯(lián)劑濃度較低時(shí)，一開(kāi)始局部進(jìn)行的是液滴內(nèi)交聯(lián)，隨后隨著交聯(lián)劑體積增加，進(jìn)行液滴間交聯(lián)，因此交聯(lián)得到的產(chǎn)物粒子分布不均勻，交聯(lián)效果差。但濃度太大，導(dǎo)致局部濃度過(guò)大而使得局部液滴間也進(jìn)行交聯(lián)，造成粒徑分布不均勻，且粒徑增加。 不同交聯(lián)劑濃度納米粒子TEM圖Fig. TEM image of nanoparticles39。通過(guò)各種表征方法分析各因素對(duì)殼聚糖納米粒子形成的粒徑與形貌的影響。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，最終確定制備載藥殼聚糖納米粒子的最佳條件為：殼聚糖濃度為15 mg/mL, 油水比為50:1，表面活性劑為油相體積的3%，交聯(lián)劑濃度為3%。 mg。 實(shí)驗(yàn)儀器表32 實(shí)驗(yàn)儀器Table 32 Apparatus used in experiment儀器名稱型號(hào)產(chǎn)地電子天平BP301S德國(guó)Sartorius 公司離心機(jī)Centrifuge 5804REppendorf超聲破碎儀JY92IIDN寧波新芝生物科技股份有限公司電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀Optima2000DV美國(guó)PerkinElmer 公司納米粒度儀NanoZS英國(guó)馬爾文(Malvern)公司透射電子顯微鏡TECNAI10荷蘭Philips 實(shí)驗(yàn)方法由第二章空白殼聚糖納米粒子的制備條件優(yōu)化得出制備殼聚糖粒子的最佳條件，即殼聚糖濃度為15 mg/mL, 油水比為50:1，表面活性劑為油相體積的3%，交聯(lián)劑濃度為3%。①水相的配制殼聚糖溶液的配置：稱取分子量為60000的殼聚糖（90%）的殼聚糖375mg溶于25 ml 2% 醋酸溶液中配制成濃度為15 mg/ml的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。含硒代胱氨酸殼聚糖溶液的配制：分別取500 μL，400 μL，200 μL SeC溶液與500 μL CS溶液混合均勻冷藏備用。取配制好的含SeC的殼聚糖溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲2h處理后形成穩(wěn)定的W/O型微乳液，然后逐漸滴加1 mL 3%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌3 h，8000 r/min離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液（CSNPs）。表33 SeC投藥量對(duì)納米粒子粒徑的影響Table 33Effect of LSeC dosage on nanoparticles39。 TEM分析TEM結(jié)果與納米粒度儀測(cè)得的平均粒徑大約相符。 不同SeC投藥量納米粒子TEM圖 Comparison of ratio of CS to SeC on nanoparticles’ shapes(F1) CS:SeC = 4:1 (F2) CS:SeC = 2:1 (F3) CS:LSeC = 1:1 包封率與載藥率的計(jì)算載藥率 = 納米粒子中所含藥物量/納米粒子總量100 %包封率 = 納米粒子中包封的藥量/投入的總藥量100 %通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 (ICPAES) 檢測(cè) F1,F2,F3中Se的含量，通過(guò)計(jì)算得到各自的包封率與載藥率。這可能是由于殼聚糖納米粒子的總量一定，隨著投藥量的增加，進(jìn)入殼聚糖納米粒子中的藥物量也增加。表34 不同SeC投藥量的包封率和載藥率Table34 Encapsulation and Loading EfficiencyNo.CS:LSeCSize()包封率載藥率F14:1 %%F22:1 %%F31:1 %% 不同SeC投藥量粒徑，包封率及載藥率Fig. Size, Encapsulation and Loading Efficiency of different SeC dosage 本章小結(jié)殼