dna重組質粒的構建概述-展示頁
2025-01-14 02:37本頁面
【正文】 胞的復制偶聯(lián)同步。質粒 DNA的特征216。v 質粒存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多。v通常質粒含有某些染色體沒有的基因，負責編碼某些功能蛋白，這些功能并不是細菌生存所必需的，但在一定環(huán)境下，可對細菌宿主的生存有利。質粒 (Plasmid)質粒是獨立于宿主細胞（如細菌）染色體之外的可進行復制和遺傳的遺傳單位 雙鏈閉合環(huán)狀超螺旋 DNA分子 。下面介紹幾種常見的載體。 BAC。 phage。DNA重組操作過程載體外源 DNA片段外源 DNA插入剪切引入宿主細胞a b bA重組A b抗性篩選重組篩選重組質粒構建： 目的 DNA的 PCR擴增 DNA片段和載體的 酶切 片段 DNA與載體的 連接載體： plasmid（ primary）工具酶：限制性內切酶 連接酶 常見的基因工程載體載體： 用于攜帶重組 DNA，并且能夠使外源 DNA一起復制與表達的運載工具。酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在較短的時間內大量生產干擾素。v基因克隆示意圖胰島素人生長激素干擾素白細胞介素 2粒細胞集落刺激因子粒細胞巨噬細胞集落刺激因子紅細胞生成素 EPO組織纖溶酶原激活劑生長激素促生長素抗血友病因子 Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體例：干擾素是治療癌癥的重要物質，人血液中每升只能提取，因而其價格昂貴。DNA重組質粒的構建醫(yī)學生物所 病毒免疫室 基因克隆 gene cloning應用酶學的方法，在體外將 目的基因 與 載體DNA結合成一具有自我復制能力的 DNA分子（重組體 ），繼而通過轉化或轉染宿主細菌或細胞、篩選出含有目的基因的轉化子細菌或細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一 DNA分子拷貝 。核心技術： DNA重組技術 （ rebinant DNA technique ）基因克隆的基本程序： 分 — 切 — 接 — 轉 — 篩 PCR 酶切 連接 轉化 轉染 抗性或標記篩選目的基因 DNA片段的獲得外源 DNA分子與載體 DNA分子的體外重組重組 DNA分子轉移到適當?shù)氖荏w菌或細胞重組 DNA 分子克隆的篩選和鑒定目的基因或其表達產物的純化和鑒定基因克隆技術的特點： 1. 可在體外人工的 , 有目的的 , 根據(jù)需要進行基因的重組、表達、測序、誘變、修復； 2. 方法簡便、快速、準確、特異，能保證研究與開發(fā)的需要。但美國有一家公司用遺傳工程方法合成了價格低廉、藥性一樣的干擾素，其具體做法是：從人的淋巴細胞中提取能指導干擾素合成的基因，并使之與一種叫做質粒的 DNA結合，然后移植到酵母菌內，從而用酵母菌來產生干擾素。利用這種方法不僅產量高，并且成本也較低 。v 根據(jù)來源： plasmid。 viral。 YACv 根據(jù)用途分：克隆載體；原核生物表達載體；真核生物表達載體v 根據(jù)與宿主的關系分：整合性載體、非整合性載體v 基因工程中用得最多的是 plasmid載體。載體的基本結構單元：其他條件：：包括宿主、轉化（或轉染）、分離純化、重組等等。是一種環(huán)狀的雙鏈 DNA分子，大小從 1K200Kb。由質粒產生的表型包括對抗生素的抗性（ R因子）、產生抗生素、降解復雜有機化合物、產生大腸桿菌素（大腸桿菌素因子 col）、 腸毒素及限制酶、修飾酶等。它們復制時利用宿主細胞復制自身染色體的同一組酶系。 質粒復制依賴宿主細胞的復制機器，但可以獨立復制。所以，往往在一個細胞中只有一份或幾份拷貝；? 松馳型：這些質粒的復制是在寄主細胞的松弛控制之下的，每個細胞中含有 10200份拷貝v 不相容質粒攜帶復制子基本相似，復制系統(tǒng)也相同，在復制和分配到子細胞的過程中相互競爭。v 質粒并非細菌生存所必不可少的遺傳物質，可以在細菌間轉移與丟失。v 多克隆位點：插入外源基因。pBR322 plasmid 是一個克隆載體，作為一個克隆載體最基本的要求都具備：復制起點 :Ori克隆位點 :EcoR I。Bam HI。Tvector PCR產物亞克隆載體 T— Vector是一種高效克隆 PCR產物 (TA Cloning) 的專用載體，由 pUC18載體改建而成的。因大部分耐熱性 DNA聚合酶反應時都有在 PCR產物的 3’末端添加一個 “A”的特性 ,所以用本制品可大大提高 PCR產物的連接、克隆效率。 用途 克隆 PCR產物。 原核生物表達載體Bacterial expression vector復制起點克隆位點篩選標記啟動子 ﹡轉錄終止序列 ﹡核糖體結和位點：起始密碼子 ATG和 SD序列（翻譯識別）原核生物表達載體的基本結構單元包括： 真核生物表達載體（ mammalian expression vector)真核生物表達載體的結構單元復制起點（真核和原核）克隆位點篩選標記 (原核和真核標記）增強子 /啟動子 ﹡PolyA ﹡終止信號Location of FeaturesPCMV IE: CMV IE enhancer: 1659 CMV IE promoter: 669750 Intervening sequence (IVS): 8901022 T7 RNA polymerase promoter: 10671085 Multiple cloning site: 10851137 T3 RNA polymerase promoter: 11581137 SV40 fragme
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