rna提取準備工作及注意事項-展示頁
2025-05-22 22:36本頁面
【正文】 液氮冷凍。投入決定產(chǎn)出；每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的，勞民傷財。抽提 RNA 的目的RNA 用于不同的后續(xù)實驗，其質(zhì)量要求不盡相同?？傊?，如果出現(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質(zhì)殘留現(xiàn)象，則必須對具體實驗材料的抽提方法/試劑進行優(yōu)化。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來用電動勻漿器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃勻漿器的，改用電動勻漿器或者直接用液氮碾磨，問題幾乎 100% 能獲得解決。勻漿器方法沒有考慮細胞與裂解液接觸前如何抑制 Rnase 活性這個問題，而是祈禱破碎組織的速度比細胞內(nèi)的 Rnase 降解 RNA 的速度快。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時候更加會有此感覺。因此，假定有一種辦法，在抑制 RNA 活性的同時能使組織變成單個細胞，降解問題也就可以徹底解決了。細胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細胞內(nèi)的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整?，F(xiàn)有的 RNA 抽提試劑，都含有快速抑制 Rnase 的成分。注意：a、處理DEPC時需要戴乳膠手套、口罩！ b、或者不用DEPC消毒，130℃，90min高壓滅菌（許多實驗室高溫滅菌兩次）二、RNA提取注意事項組織 RNA 抽提失敗的兩大現(xiàn)象是： RNA 降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留。經(jīng)檢測不含 RNase、DNase和proteinase。一、槍頭和EP管等的消毒滅菌%（千分之一）的DEPC（劇毒物），須在通風櫥中小心使用，避光，密閉4℃保存。DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQ純水。%的DEPC內(nèi)，%的DEP,避光、靜置、過夜（1224 h）裝槍頭和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，將槍頭或者EP管內(nèi)的DEPC水大致去除干后，裝起，包好121攝氏度，30min180攝氏度，干燥數(shù)個鐘頭（至少3小時以上）。關于降解問題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細胞中抽提 RNA 不容易降解。在培養(yǎng)細胞中加入裂解液，簡單的混勻，即可使所有的細胞與裂解液充分混勻，細胞被徹底裂解。也就是說，培養(yǎng)細胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其 RNA 不容易被降解；反過來講，組織中的 RNA 之所以容易被降解，是因為組織中的細胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。液氮碾磨就是最有效的這樣一種辦法。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。電動勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來說，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。影響后續(xù)實驗的雜質(zhì)殘留問題，其原因比降解更多樣，解決方法相應也不同。優(yōu)化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場上購買一些魚/雞之類的小動物，取相應部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白質(zhì) – 用嘴碾磨，腸胃抽提。cDNA 文庫構建要求 RNA 完整而無酶反應抑制物殘留；Northern 對 RNA 完整性要求較高，對酶反應抑制物殘留要求較低；RTPCR 對 RNA 完整性要求不太高，但對酶反應抑制物殘留要求嚴格。樣品的收集/保存 – 影響降解的因素樣品
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