膠體金快速免疫診斷技術(shù)-文庫(kù)吧資料
2024-11-19 22:14本頁(yè)面
【正文】 C\T線噴點(diǎn)工藝與接觸劃點(diǎn)工藝比較 因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面,而膜本身的物理性質(zhì)為軟脆,劃管會(huì)在其表面留下印痕.劃痕容易對(duì)層析的金標(biāo)復(fù)合物形成阻力,導(dǎo)致假陽(yáng)性。所以這里就有一個(gè)讀數(shù)時(shí)間/反應(yīng)靈敏度/非特異性結(jié)合的均衡. 不同膜廠家的產(chǎn)品 (Whatman,Millipore,Sartorius) 大致為: 135s和180s,抗原、抗體包被固相NC膜的制備,包被流腦抗原濃度篩選（T線） 抗原用PBS 梯度稀釋, 釋后用1μl移液器點(diǎn)在NC 膜上,37 ℃干燥1 h 備用 。 （生產(chǎn)階段）,選擇NC膜,NC膜的選擇 爬速(???秒/4cm)對(duì)靈敏度的影響 通過同一T線噴點(diǎn)位置時(shí), 金溶液通過的速度是快速膜慢速膜. 那么通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時(shí)間也就越短, 讀數(shù)快, 那么靈敏度也就越低. 反之, 反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng), 讀數(shù)慢, 也就靈敏度高。,膠體金蛋白結(jié)合物玻璃纖維素膜制備,膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgG放入玻璃纖維素膜浸泡10分鐘，取出至37度烤箱中烤干，熱合封口，置4攝氏度冰箱備用。 金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測(cè)定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法。 OD520nm值測(cè)定：用PBS液（含1%BSA）將膠體金蛋白試劑作1:20稀釋，OD520＝0.25左右?；蛴么姿徕檹?fù)染后觀察。 以上操作中應(yīng)注意，一切溶液中不應(yīng)含雜質(zhì)微粒，可用高速離心或微孔濾膜預(yù)處理。 ⑥包被后的金溶膠也可濃縮后于Sephadex G200柱進(jìn)行凝膠層析分離純化，以含 0.1%BSA的緩沖溶液洗脫。 ④于10000～100000g離心30～60分鐘小心吸去上清液（切忌傾倒）。 ②于100ml 金溶膠中加入最佳標(biāo)記量的蛋白質(zhì)溶液攪拌2～3分鐘。加入的量：5％BSA使溶液終濃度為1%；1%聚乙二醇加至總?cè)芤旱?/10。 膠體金與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后，加入穩(wěn)定劑，以避免產(chǎn)生凝集。,1,2,3,4,5,7,6,膠體金(ml) 1 1 1 1 1 1 1 蛋白質(zhì)(ug) 0 10 15 20 25 30 35 10%NaCl 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1,結(jié)果判斷: 對(duì)照管或加入蛋白量不足，膠體金出現(xiàn)由紅變藍(lán)的凝聚現(xiàn)象；加入蛋白質(zhì)量達(dá)到或超過穩(wěn)定量，則膠體金保持紅色不變,不穩(wěn)定的金溶膠將發(fā)生聚沉，對(duì)照管（未加蛋白質(zhì)）和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力。 2.用微孔濾膜或超速離心除去蛋白質(zhì)溶液中的細(xì)小微粒。 蛋白質(zhì)的預(yù)處理: 1.蛋白質(zhì)應(yīng)先對(duì)低離子強(qiáng)度的水透析，去除鹽類成份。 3. 電鏡可見精確測(cè)定金顆粒的大小。同時(shí)良好的膠體金應(yīng)該是清澈透明的，若渾濁或有漂浮物提示有較多的凝集顆粒。根據(jù)需要迅速加入1％枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。將玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分鐘，室溫干燥后蒸餾水沖洗，再干燥備用 。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀
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