浙江大學(xué)膠體金免疫標(biāo)記培訓(xùn)班資料-文庫(kù)吧資料
2025-06-30 04:16本頁(yè)面
【正文】 min，除去多余膠體金探針A；(8) 重復(fù)步驟(2)(7)，其中抗體和探針改用一抗B和大顆粒膠體金探針B；(9) dd H2O上漂洗除去未標(biāo)記的膠體金探針，共漂洗3次，每次510 min；晾干；(10) 常規(guī)染色，觀察。6．膠體金直接標(biāo)記基本程序(1) 在培養(yǎng)皿中鋪上石蠟?zāi)?parafilm)；四周加吸水紙和水以保濕；(2) 加一滴dd H2O，鎳網(wǎng)切片向下漂浮2 min；(3) 另滴50 ml封閉液(BL)，將鎳網(wǎng)切片向下漂浮30 min；(4) 另滴50 ml封閉液(BL)，加入23 ml膠體金探針，充分混勻；將鎳網(wǎng)切片向下漂浮30 min；(5) 標(biāo)記后鎳網(wǎng)的在dd H2O上漂洗除去未標(biāo)記的膠體金探針，共漂洗3次，每次510 min；晾干；(6) 常規(guī)染色，觀察。（7） 聚合后的樣品可長(zhǎng)時(shí)間保存。（6） 在70176。 ml的離心管中， ml包埋劑即可。C或室溫下依次用30%、50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶液脫水，每步15 min；（4） 依次用30%、70%、100%的Spurr包埋劑滲透，每步120 min；然后在100%的Spurr包埋劑中過(guò)夜。C下固定6－12 h；（2） 樣品用磷酸緩沖液沖洗3次每次5 min；然后在2%鋨酸溶液中固定1 h；沖洗3次，每次5分鐘。(3) 脫水過(guò)程中防止樣品結(jié)霜吸潮。濺入眼睛或皮膚時(shí)請(qǐng)立刻用清水沖洗。具體參見包埋劑說(shuō)明。K4M的配方根據(jù)材料的性質(zhì)確定。與其它標(biāo)記用包埋劑相比，K4M可在35176。(7) 聚合后的樣品應(yīng)及時(shí)切片，長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)導(dǎo)致樣品與包埋劑之間分離而無(wú)法切片。室溫下聚合48 h。(6) 在20176。C K4M樹酯包埋。C冰箱中依次用30%、70%、100%的K4M滲透，每步120 min；注意不斷輕輕搖動(dòng)樣品使?jié)B透完全。C依次用30%、50%乙醇溶液脫水，每步30 min；(3) 在20176。 4．樣品的低溫包埋的基本程序(1) 將新鮮樣品切成113 mm3的小塊，立即放入3%甲醛和1%戊二醛的磷酸緩沖液(100 mM, pH )中4176。也有人發(fā)現(xiàn)IgG探針標(biāo)記時(shí)脫脂奶粉最佳。目前最常用的封閉液組分有BSA、卵清蛋白、脫脂奶粉、PEG20000等。（4）封閉液組成封閉液對(duì)封閉有關(guān)非特異性活性基團(tuán)，特別是醛基至關(guān)重要。但我們研究發(fā)現(xiàn)事實(shí)并非如此，在25℃以上的室溫下標(biāo)記2060 min其特異性更好。建議在可能時(shí)盡量使用外切酶探針。以水解酶類做成的膠體金探針對(duì)溫度變化也更為敏感，不同溫度、不同時(shí)間標(biāo)記出的切片其視覺效果完全不一樣。有時(shí)溶液中Ca2+、Cu2+等容易形成不溶性沉淀而導(dǎo)致標(biāo)記失??；因此，在配制標(biāo)記溶液時(shí)要注意各種陰陽(yáng)離子的配伍，添加順序及溶液pH。例如有一種來(lái)自真菌的纖維素酶本來(lái)在pH ，但結(jié)合到膠體金上后。影響標(biāo)記的因素主要包括以下方面：（1）pHpH變化會(huì)對(duì)探針蛋白的結(jié)構(gòu)與活性中心產(chǎn)生影響，繼而影響到標(biāo)記強(qiáng)度與特異性。間接標(biāo)記無(wú)需制備膠體金探針，可以直接購(gòu)買通用二抗探針，缺點(diǎn)是標(biāo)記特異性較難把握，背景較高，不能夠做陰性對(duì)照。直接標(biāo)記指膠體金探針直接與被標(biāo)記底物結(jié)合；而間接標(biāo)記指膠體金探針通過(guò)一或多個(gè)中間標(biāo)記物后與底物結(jié)合。Spurr包埋劑粘性小，易滲透，易操作；包埋塊不吸潮，保存時(shí)間長(zhǎng)。大量實(shí)驗(yàn)表明，K4M是目前使用最為普遍的低溫包埋劑。2．包埋根據(jù)標(biāo)記低物的不同，可以選擇常規(guī)（常溫）包埋劑或低溫包埋劑包埋樣品。戊二醛對(duì)細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)保存較好，但往往導(dǎo)致蛋白失去抗原活性。甲醛分子量小、滲透快，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響小，可較好地保存其抗原活性。C以下。三、樣品的固定、包埋與標(biāo)記1．固定為了減少對(duì)標(biāo)記底物結(jié)構(gòu)的破壞，細(xì)胞化學(xué)樣品固定的時(shí)間相對(duì)較短，多為13小時(shí)。4).IgG的最佳交聯(lián)pH有多種報(bào)導(dǎo)。最好能夠直接用膠體金在不同轉(zhuǎn)速下離心以確定適當(dāng)?shù)碾x心力。以絕大部分探針形成松散沉淀為原則。IgGgold的制備(1) ml試管， ml 10 nm膠體金；(2) 加入適量25 mM ；(3) 分別加入10 ml濃度為1 mg/ml IgG，混勻，室溫放置10min；(4) 分別加入12 ml 2% PEG20000，室溫放置5 min；(5) 10000 rpm離心20 min，輕輕吸除上清；(6) 用20 ml BL溶液重懸浮松散的膠體金沉淀，并集中到新管中；(7) 分別加20 ml 甘油，充分混勻；(8) 20℃保存?zhèn)溆谩?6) 為確保結(jié)果準(zhǔn)確性，可放大反應(yīng)體積重復(fù)以上步驟。2．有些蛋白最佳pH范圍較窄，設(shè)置的梯度不能太大。注意：1．如膠體金粒子直徑較小（3～6nm），加NaCl需放置較長(zhǎng)時(shí)間（幾個(gè)甚至十幾個(gè)小時(shí)）后才能觀察到顏色變化。其基本過(guò)程如下：(1) 用PBS（pH ，含10 mM EDTA，20 mM鹽酸半胱氨酸）溶解純化的IgG(2) 加固化木瓜蛋白酶(3) 37℃處理5h(4) 離心，去除固化木瓜蛋白酶（沉淀）(5) 過(guò)Protein G柱(6) 純化的Fab片段按前文方法做進(jìn)一步處理注：蛋白與膠體金結(jié)合最佳pH測(cè)定(例纖維素酶，pI未知)(1) ，分別加入1 ml 10 nm膠體金；(2) 用25 mM K2CO3將pH分別調(diào)為3，4，5，6，7，8，9，10；(3) 取一96孔培養(yǎng)板，按pH從低到高分別將上述膠體金分別取100 ml加入孔中，重復(fù)三次；(4) 每孔分別加入3 ml濃度為1 mg/ml的纖維素酶，混合，室溫下放置1015 min；(5) 每孔分別加入20 ml濃度為10％ NaCl溶液，混合，室溫下放置10 min；(6) 觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH(X)；(7) 重復(fù)(1)(5)步，；；X；X+；X+；X+1。Fc能夠與Protein A和Protein G特異性結(jié)合。用水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可得到兩種片段，即Fab和Fc。主要原因在于膠體金顆粒較小時(shí)有利于在標(biāo)記溶液中的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)；在膠體金直徑一定時(shí)，蛋白分子量越小，金表面吸附的蛋白分子越多，活性位點(diǎn)也越密集，也容易于靶位點(diǎn)結(jié)合。我們建議在制備通用探針（如二抗IgG，Protein A，Protein G，Streptavidin）等時(shí)，嚴(yán)格使用該方法，而制備直接標(biāo)記探針時(shí)，也可以忽略處理步驟。但注意后一種透析液的pH值應(yīng)與交聯(lián)時(shí)pH值一致。因此前處理的目的在于脫鹽和解聚。一般為羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人的抗體。如果抗血清效價(jià)較低時(shí)，不宜準(zhǔn)備膠體金探針。為最大限度保持抗體活性，整個(gè)過(guò)程應(yīng)在4℃下進(jìn)行。大量工作表明，只用硫酸銨沉淀就可以得到足夠純度及高活性的IgG蛋白。但處理環(huán)節(jié)不宜太繁，在實(shí)驗(yàn)室設(shè)備與經(jīng)驗(yàn)缺乏的情況下更是如此，否則會(huì)導(dǎo)致IgG活性的大幅降低。用抗血清直接制備探針其標(biāo)記活性與特異性均不理想。因此，在探針制備每一環(huán)節(jié)應(yīng)隨時(shí)監(jiān)測(cè)探針對(duì)分布情況、負(fù)染結(jié)合及活性。在標(biāo)記位點(diǎn)希少、被標(biāo)記物含量較少的情況下要特別注意。如果在制備探針時(shí)加入太多的蛋白，不僅造成浪費(fèi)，而且更為嚴(yán)重的是容易造成探針凝聚，并嚴(yán)重影響標(biāo)記活性。這要靠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。一般選擇最小適宜pH值為最佳pH值。在高濃度電解質(zhì)（如NaCl）作用下不會(huì)凝聚
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