【正文】 狀 DNA(CCC每個細(xì)胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。一個完整的基因克隆過程包括以下步驟? １、獲得待克隆的 DNA片段（基因）；? ２、目的基因與載體在體外連接；? ３、重組 DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；? ４、篩選、鑒定陽性重組子；? ５、重組子的擴(kuò)增與／或表達(dá)。在 5～ 6個平皿上可測 20株菌以上。 — 個平皿測一個菌。待凝固后，分別在平皿的 5～ 6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。 驗(yàn)證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長譜測定。 ? 此法缺點(diǎn)是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易 。(三 )夾層法? 先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的 MM，凝固后再倒一薄層 MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24h，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上一層 CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。? 此法結(jié)果明確，但工作量大。(二 )點(diǎn)種法? 也就是任意法。? 此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。? 5．二平皿相同方位進(jìn)行比較， 即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長出的菌落少于 GM平板上的。 ? 2．將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標(biāo)記方位。三、檢出缺陷型? 原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在 CM上生長良好，而在 MM上則不生長，野生型都能生長。? 菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。由于細(xì)菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。medium） —— 可滿足該菌各種 營養(yǎng)缺陷型 菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。? 　 　 ③ 完全培養(yǎng)基（ C． M．， supplementalmedium） —— 能滿足某一菌種的野生型或原養(yǎng)型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。? 與營養(yǎng)缺陷型對應(yīng)的是野生型 。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡率。吸取 MNNG溶液 lml，加入到 1m1孢子懸液中， 30℃ 振蕩 30min，立即稀釋 1000倍停止作用，然后以 102， 104兩個稀釋度分離培養(yǎng)， 30℃ 3．誘變處理 pH用分析天平稱取 2mg，加入 2ml 2． MNNG溶液的制備 ，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達(dá) l06個／ ml，此為待處理孢子懸液。取斜面，加入 6ml1．單孢子懸液制備 ? 其精確的作用機(jī)制尚不很清楚，據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細(xì)胞內(nèi)的 DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。N— 甲基 —N39。 亞硝基胍誘變曲霉菌? 6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。4．取未照射的制備菌液和照射菌液各 行 稀釋分離 ，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。在正式照射前，應(yīng)先開紫外線 10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射 10～ 50s。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá) 108個／ ml左右，作為待處理菌懸液。 1．將細(xì)菌培養(yǎng)液以 3000r／ min離心 5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌 生理鹽水 再離心洗滌。(二 )操作步驟? 由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。/ml。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在 70～ 80%為宜。搖床復(fù)篩降解纖維素產(chǎn)生產(chǎn)透明圈病毒產(chǎn)生產(chǎn)空斑紫外線的誘變育種? ? 在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。? 復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。(五 )分離和篩選? 篩選分初篩和復(fù)篩。 方法： 讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細(xì)胞繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。(四 )中間培養(yǎng)? 由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細(xì)胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程 (生理延遲 )，需 3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實(shí)際，設(shè)計(jì)誘變處理方案。(二 )處理菌懸液的制備? 這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進(jìn)行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細(xì)胞，就要選對數(shù)期的細(xì)胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。5．要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。二、誘變育種步驟?出發(fā)菌株的選擇?處理菌懸液的制備?誘變處理?中間培養(yǎng)?分離和篩選(一 )出發(fā)菌株的選擇1．自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達(dá)到好的效果。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。3．吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。2．亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當(dāng)心。而用電離輻射 177。使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點(diǎn)：大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。? 超凈工作臺小型 X射線衍射儀Co60射線機(jī)化學(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類似物、 5— 氟尿嘧啶、烷化劑等。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實(shí)驗(yàn)室、中小型工廠都適用，也很安全。一、誘變劑和誘變處理? ? 誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。賦予菌種對多種底物，特別是價廉而豐富的底物的利用能力，由此可降低操作費(fèi)用。? b.通過確定并改變代謝中的耗能部分 。a.提高特定基因的表達(dá)水平? (1)引入強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號，可通過在一高效表達(dá)載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強(qiáng)啟動子；修改現(xiàn)有表達(dá)信號，提高基因效力等。如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。 (5)改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力。 (3)改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。(2)增加前體物的濃度。 (1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達(dá)能力來提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。? 如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機(jī)誘變、篩選及選育等技術(shù)：? 如果對其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認(rèn)識，則可選擇基因重組等手段進(jìn)行定向育種。(1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系 (如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn) )； ? (3)改良菌種的評價 (包括實(shí)驗(yàn)規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模 )。 (1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強(qiáng)化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。是在長年累月的生產(chǎn)實(shí)踐中，在培養(yǎng)工藝條件沒有任何可見變更情況下，突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大，這就有可能是個別自然變異朝更好的方向變的細(xì)胞，在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件，并逐漸顯示出它的生長優(yōu)勢，這種優(yōu)勢的發(fā)展，促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露。七、生產(chǎn)選種? 餌誘技術(shù)常用于水中真菌的富集。? 植物材料中真菌的分離：植入法，壓貼法，洗滌法，浸泡法。在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效地抑制細(xì)菌生長及菌落形成。有時，真菌子實(shí)體形成必須有光線，這在分離培養(yǎng)時應(yīng)加以考慮。這里主要是利用營養(yǎng)成分的減少而使生長減慢，并由此限制真菌的遷徙生長。? 將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng)，以進(jìn)一步篩選和分離。? 通過高倍放大進(jìn)行鏡檢，可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況。為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或?yàn)V紙過濾，取 離心沉積或?yàn)V紙表面沉積 進(jìn)行系列稀釋和涂布。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。放線菌的分離? 土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣 風(fēng)干 ，磨碎，無菌海綿壓印土樣