【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來(lái)挑取參加復(fù)篩者，而將 90%的菌落淘汰。? 在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再?gòu)?fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。搖床復(fù)篩降解纖維素產(chǎn)生產(chǎn)透明圈病毒產(chǎn)生產(chǎn)空斑紫外線的誘變育種? 紫外線誘變一般采用 15W紫外線殺菌燈，波長(zhǎng)為 2537A．燈與處理物的距離為 15～ 30cm，照射時(shí)間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在 70～ 80%為宜。? 被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為 106個(gè) /ml左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為 106～ 107個(gè) /ml。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約 ～ ，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。? 由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。(二 )操作步驟 1．將細(xì)菌培養(yǎng)液以 3000r／ min離心 5min，傾去上清液，將菌體打散加入無(wú)菌 生理鹽水 再離心洗滌。2．將菌懸液放入一已滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)用手搖動(dòng)，以 打散菌體 。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過(guò)濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá) 108個(gè)／ ml左右，作為待處理菌懸液。3．取 2～ 4m1制備的菌液加到直徑 9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無(wú)菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下 30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外線 10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射 10～ 50s。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光。4．取未照射的制備菌液和照射菌液各 行 稀釋分離 ，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。5．取照射菌液 2ml于液體培養(yǎng)基中 (300ml三角瓶?jī)?nèi)裝 30ml培養(yǎng)液 )， 120r／ min振蕩培養(yǎng) 4～ 6h。6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。7．挑取菌落進(jìn)行篩選。亞硝基胍誘變曲霉菌? N— 甲基 —N39。 硝基 N亞硝基胍 (NGN，MNNG或 TG)對(duì)真核或原核微生物都有強(qiáng)烈的誘變作用。其精確的作用機(jī)制尚不很清楚，據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細(xì)胞內(nèi)的 DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。 MNNG的誘變作用隨 pH的升高而增強(qiáng)。? (二 )操作步驟1．單孢子懸液制備 取斜面，加入 6ml／ L，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過(guò)帶濾紙漏斗過(guò)濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達(dá) l06個(gè)／ ml，此為待處理孢子懸液。 2． MNNG溶液的制備 用分析天平稱取 2mg，加入 2ml／ LpH，于暗處振蕩溶解。3．誘變處理 吸取 MNNG溶液 lml，加入到 1m1孢子懸液中， 30℃ 振蕩 30min，立即稀釋 1000倍停止作用，然后以 102， 104兩個(gè)稀釋度分離培養(yǎng)， 30℃ 3天后計(jì)數(shù)。4． 死亡率計(jì)算 將未處理的孢子液 1ml加入 1ml磷酸緩沖液中，同上逐級(jí)稀釋分離， 30℃ 下培養(yǎng) 3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡率。5．挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選．第五節(jié) 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指通過(guò)誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分才能正常生長(zhǎng)的變異株。? 與營(yíng)養(yǎng)缺陷型對(duì)應(yīng)的是野生型 。? 與篩選 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 有關(guān)的三類培養(yǎng)基? 　 　 ① 基本培養(yǎng)基（ M． M．， minimalmedium） —— 能滿足某一菌種的野生型或原養(yǎng)型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。? 　 　 ② 補(bǔ)充培養(yǎng)基（ S． M．， supplementalmedium） —— 在基本培養(yǎng)基中有針對(duì)性地補(bǔ)加某一種或幾種營(yíng)養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 菌株生長(zhǎng)需要（其他 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 仍不能生長(zhǎng)）的培養(yǎng)基。? 　 　 ③ 完全培養(yǎng)基（ C． M．， pletemedium） —— 可滿足該菌各種 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的用途? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的步驟? 誘變? 淘汰野生型? 檢出缺陷型? 確定生長(zhǎng)譜一、誘變方法? 物理誘變? 化學(xué)誘變二、淘汰野生型? 抗生素法：野生型能在 MM中生長(zhǎng)，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在 MM中培養(yǎng)短時(shí)讓野生型生長(zhǎng)，處于活化階段， 而缺陷型無(wú)法生長(zhǎng)，仍處于休眠狀態(tài) 。由于細(xì)菌或酵母對(duì)一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細(xì)菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。? 菌絲過(guò)濾法：對(duì)于霉菌，因孢子生長(zhǎng)后會(huì)長(zhǎng)出菌絲體，就可用濾紙過(guò)濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過(guò)。三、檢出缺陷型? 原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)情況完全不同，缺陷型在 CM上生長(zhǎng)良好，而在 MM上則不生長(zhǎng)，野生型都能生長(zhǎng)。 ? 具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法 ? 1．將一較平皿直徑小 1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。? 2．將完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標(biāo)記方位。? 3．將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。 (一 )影印法? 4 ．將 CM和 MM在恒溫箱中培養(yǎng)。? 5．二平皿相同方位進(jìn)行比較， 即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長(zhǎng)出的菌落少于 GM平板上的。 MM上未長(zhǎng)而相應(yīng)于 CM上長(zhǎng)出的那幾個(gè)菌落就可能是缺陷型。? 此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。(二 )點(diǎn)種法? 也就是任意法。? 用接種針或牙簽將 CM上長(zhǎng)出的菌落在 MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況。? 此法結(jié)果明確，但工作量大。(三 )夾層法? 先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的 MM，凝固后再倒一薄層 MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24h，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上一層 CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時(shí)第二批長(zhǎng)出的菌落就可能是缺陷型。? 此法缺點(diǎn)是，結(jié)果有時(shí)不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易 。四、營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)譜的確定? 驗(yàn)證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長(zhǎng)譜測(cè)定。生長(zhǎng)譜測(cè)定的方法? 將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細(xì)胞懸液，與 MM培養(yǎng)基 (融化并涼至 50℃) 混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的 5～ 6個(gè)區(qū)間放上不同的營(yíng)養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營(yíng)養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會(huì)在某組合區(qū)長(zhǎng)出，就可測(cè)得所需營(yíng)養(yǎng)。 — 個(gè)平皿測(cè)一個(gè)菌。? 以不同組合的營(yíng)養(yǎng)混合物與融化涼至 50℃ 的 MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個(gè)缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長(zhǎng)出可推知其營(yíng)養(yǎng)因子。在 5～ 6個(gè)平皿上可測(cè) 20株菌以上。第六節(jié) 基因育種? 基因重組育種：是運(yùn)用體外 DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，或者通過(guò)細(xì)胞間的相互作用，使一個(gè)細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另— 個(gè)細(xì)胞的方法。一個(gè)完整的基因克隆過(guò)程包括以下步驟? １、獲得待克隆的 DNA片段（基因）；? ２、目的基因與載體在體外連接；? ３、重組 DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；? ４、篩選、鑒定陽(yáng)性重組子；? ５、重組子的擴(kuò)增與／或表達(dá)?；蛑亟M一、質(zhì)粒的特點(diǎn)質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動(dòng)必需。每個(gè)細(xì)胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異，同一質(zhì)粒在不同條件下，拷貝數(shù)也可能差異很大，有嚴(yán)緊型和松弛型兩種。質(zhì)粒 DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見的一種是共價(jià)、閉環(huán)狀 DNA(CCC DNA)；其次是由于 —條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán) DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性 DNA。質(zhì)粒載體二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細(xì)胞的不同表現(xiàn)型抗生素抗性：抗生素的產(chǎn)生；大腸桿菌素的產(chǎn)生；腸毒素的產(chǎn)生；復(fù)雜有機(jī)化合物的降解；限制性核酸內(nèi)切酶和修飾酶的產(chǎn)生；殺傷性能。在自然條件下，許多質(zhì)?？山?jīng)細(xì)菌接合或相似方式在宿主間相互轉(zhuǎn)移。在實(shí)驗(yàn)