分子生物學(xué)基本技術(shù)—pcr(polymerasechainreaction)-文庫吧資料
2025-01-05 03:23本頁面
【正文】 較敏感。 ? Buffer： 1050mmol/L TrisHCl(, 20℃ )。 ? Mg2+ ： for Taq polymerase activity Mg2+對 PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的 PCR反應(yīng)中，各種 dNTP濃度為 200umol/L時， Mg2+濃度為 ～ 。濃度過低又會降低 PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。 ? dNTPs： dNTP的質(zhì)量與濃度和 PCR擴增效率有密切關(guān)系，多次凍融會使 dNTP降解。純化引物在 25％乙腈溶液中 4℃ ；凍干引物于 20℃ 可保存12年，液體狀態(tài)于 20℃ 可保存 6個月。 10．解鏈溫度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) [ =20 nt ] Tm = +*(GC%)600/L [ 20nt] Tm一般５５ ℃ ～８０ ℃ ［５５ ℃ ～５８ ℃ 最佳］ PCR反應(yīng)中結(jié)合溫度（ anneaning temperature） T = Tm 5℃ ?P+、 P的設(shè)計方法 四、 PCR反應(yīng)體系 標(biāo)準(zhǔn)的 PCR反應(yīng)體系： 10擴增緩沖液 10ul 4種 dNTP混合物 各 200umol/L 引物 各 10～ 100pmol 模板 DNA ～ 2ug Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加雙或三蒸水至 100ul ? Template（模板）： ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA模板核酸的量與純化程度，是 PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。 (僅 binding , 不含接頭 ) 2. G + C 含量 40％～ 60％，而且四種堿基的分布最好隨機。 這種熱變性 復(fù)性 延伸的過程就是一個PCR循環(huán)， PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。 ? 1993年： Mullis與開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點誘變”加拿大籍英國科學(xué)家 Michael Smith共獲諾貝爾化學(xué)獎 Kary Mullis Michael Smith 穆利斯（ Kary Mullis） 美國化學(xué)家 1944～ 史密斯（ Michael Smith） 加拿大化學(xué)家 1932～ 二、 PCR的基本原理 ?PCR的基本原理： 變性、復(fù)性、半保留復(fù)制 ? PCR三步曲 Three steps： Denaturation 變性 90～ 97℃ Primer annealing 退火 45～ 55℃ Polymerization 延伸 72℃ 原 理 5 ’ 3 ’ 3 ’ 5 ’ 類似于 DNA的體內(nèi)復(fù)制。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。分子生物學(xué)基本技術(shù) — PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR(Polymerase Chain Reaction) ? 一、歷史及其發(fā)展 ? 二、 PCR的基本原理
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