分子生物學(xué)基本技術(shù)—pcr(polymerasechainreaction)-展示頁
2025-01-07 03:23本頁面
【正文】 ? 三、 Primer design引物常規(guī)設(shè)計(jì)原則 ? 四、 PCR反應(yīng)體系 ? 五、 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化（ PCR optimization) ? 六、 PCR反應(yīng)特點(diǎn) ? 七、 PCR產(chǎn)物的分析 ? 八、 Molecular marker ? 九、 PCR技術(shù)的應(yīng)用 分子生物學(xué)技術(shù)體系 ? 基本技術(shù) ?基因及產(chǎn)物 分子檢測技術(shù) ?基因及產(chǎn)物 獲取技術(shù) ?基因 功能研究技術(shù) 基本技術(shù) 1. 瓊脂糖凝膠電泳 2. SDSPAGE 電泳 3. PCR技術(shù) 4. 細(xì)菌轉(zhuǎn)化 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR(Polymerase Chain Reaction) 一、歷史及其發(fā)展： ? 1971年 ， Khorana提出：經(jīng)過 DNA變性 ，與合適引物雜交 ， 用 DNA聚合酶延伸引物 ， 并不斷重復(fù)該過程便可克隆 tRNA基因 。 ? 但由于測序和引物合成的困難 ， 以及 70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能 ， 所以 ， Khorana的設(shè)想被人們遺忘了 …… ? 1985年 ， 美國 PECetus公司的 Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng) （ PCR） ? 基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的 DNA復(fù)制 ? 最初采用 Ecoli DNA聚合酶進(jìn)行 PCR， 由于該酶不耐熱 ， 使這一過程耗時(shí) ， 費(fèi)力 ， 且易出錯 ? 耐熱 DNA聚合酶的應(yīng)用使得 PCR能高效率的進(jìn)行 ，隨后 PECetus公司推出了第一臺 PCR自動化熱循環(huán)儀 1988年初， Keohanog改用 T4 DNA聚合酶進(jìn)行 PCR，其擴(kuò)增的 DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種 DNA片段。 ? 1988年 Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA聚合酶。首先待擴(kuò)增 DNA 模板加熱 變性 解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生 退火 ，再將溫度升高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以 延伸 。 回憶： DNA 的復(fù)制 …… DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ 解旋酶 解鏈酶 回憶： DNA 的復(fù)制 …… RNA引物 RNA引物 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ 引物酶 引物酶 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 回憶： DNA 的復(fù)制 …… ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3’ ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 3’ DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 回憶： DNA 的復(fù)制 …… 變變變變變變90變95變40變60變70變75變PCR簡要過程圖解 PCR詳細(xì)過程圖解 1 2 3 4 5
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