分子生物學(xué)基本技術(shù)—pcr(polymerasechainreaction)(參考版)
2025-01-03 03:23本頁(yè)面
【正文】 ?它將 RAPD隨機(jī)性和專一性擴(kuò)增巧妙結(jié)合，再選用內(nèi)切酶以達(dá)選擇的目的。 （三） AFLP(Amplified Restriction fragment polymorphism) ? 基本原理： ?結(jié)合了 RFLP和 PCR技術(shù)的特點(diǎn) ，具有 RFLP技術(shù)的可靠性和 PCR 技術(shù)高效性。 RAPD易發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，敏感性高。 RAPD只需一個(gè)引物，長(zhǎng)度 910個(gè)核苷酸，而且是隨機(jī)引物。 ? 自從人的 RFLP圖譜構(gòu)建后，又分別構(gòu)建了果蠅、牛、大豆、小麥、水稻等多種生物的 RFLP圖譜。 ?核酸序列分析 是檢測(cè) PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈 (內(nèi)部寡核苷酸 )標(biāo)記后做探針，與 PCR產(chǎn)物雜交。 ? 酶切分析 根據(jù) PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。 ? PCR產(chǎn)物電泳 EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。 七、 PCR產(chǎn)物的分析 ? 凝膠電泳分析 通常應(yīng)用 1～ 2%的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。 ? ： DNA 粗制品及總 RNA均可作為擴(kuò)增模板。 ? ： PCR產(chǎn)物的生成量以指數(shù)方式增加 ? 、快速： PCR反應(yīng)一般在 2～ 4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。一般的循環(huán)次數(shù)選在 30～ 40次之間，循環(huán)過多，非特異性產(chǎn)物大量增加，循環(huán)次數(shù)決定 PCR擴(kuò)增程度。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。一般： 1Kb以內(nèi)的 DNA片段，延伸時(shí)間 1min是足夠 的 3～ 4kb的靶序列需 3～ 4min 10Kb需延伸至 15min。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值 (解鏈溫度 )=4(G+C)＋ 2(A+T) 復(fù)性溫度 =Tm值 (5～ 10℃ ) 延伸溫度和時(shí)間 ?溫度 ： 72℃ ，接近 Taq酶的最適 75℃ ，高于 90℃ 時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行 ?Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性 ： 70～ 80℃ 150核苷酸 /S/酶分子 70℃ 60核苷酸 /S/酶分子 55℃ 24核苷酸 /S/酶分子 ?時(shí)間 ：過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。通常 3755℃ 、 12分鐘。 退火 (復(fù)性 )溫度與時(shí)間 ? 引物中 G、 C含量高、 長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板完全配對(duì)時(shí)，應(yīng)提高溫度。 Taq DNA聚合酶 酶活性(%) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 五、 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化（ PCR optimization) 變性溫度和時(shí)間 ? 一般情況下， 92℃ ～ 95℃ l5min足以使模板 DNA變性，若低于93℃ 則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。 忠實(shí)性 : 沒有校正單核苷酸錯(cuò)配功能 致命弱點(diǎn)。 分離 : 1969年，美國(guó)黃石國(guó)家公園溫泉 分子量 : 94KDa 活性： 在幾種水生棲熱菌中活性最高， 200 000U/mg 離子需要： 對(duì) Mg2+、單價(jià)離子性質(zhì)和濃度
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