分子生物學(xué)基本技術(shù)—pcr(polymerasechainreaction)-在線瀏覽
2025-02-02 03:23本頁面
【正文】 22 55 72 94 時(shí)間（ min） 溫度 （ ℃ ） 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù) 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴(kuò)增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復(fù)性 DNA變性 形成2條單鏈 子鏈延伸 DNA加倍 模板 DNA 95℃ 1 50℃ 引物 1 引物 2 DNA引物 2 引物 1 引物 2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 3 第 1輪結(jié)束 95℃ 第 2輪開始 4 72℃ Taq Taq Taq Taq 5 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 模板 DNA 第 1輪擴(kuò)增 第 2輪擴(kuò)增 第 3輪擴(kuò)增 第 4輪擴(kuò)增 第 5輪擴(kuò)增 第 6輪擴(kuò)增 三、 Primer design引物常規(guī)設(shè)計(jì)原則 1. 長度： 1537 nt, 一般 20nt左右 。 3. 避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)； 4. 引物自身不能互補(bǔ)（ 3個(gè)） 5. 引物之間不能互補(bǔ)（ 5 個(gè)） 6. 引物３端不能錯(cuò)配 , 不能修飾，盡量不用 T, 不能超過３個(gè)連續(xù)的 G或 C； 7. ５端可變化修飾，附加酶切位點(diǎn)； 8. 兩引物的 Tm值應(yīng)比較接近； 9. 正鏈引物： mRNA序列照抄； 負(fù)鏈引物：先寫出 mRNA序列的互補(bǔ)序列，然后翻轉(zhuǎn)重寫。 ? Primes（引物）： 每條引物的濃度 ～ 1umol或 10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，增加二聚體的機(jī)會(huì)。不用時(shí)應(yīng) 20℃ 保存。在 PCR反應(yīng)中， dNTP應(yīng)為50～ 200umol/L，尤其是注意 4種 dNTP的濃度要相等 ( 等摩爾配制 )，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí) (偏高或偏低 )，就會(huì)引起錯(cuò)配。dNTP能與 Mg2+結(jié)合，使游離的 Mg2+濃度降低。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。 ? Taq DNA polymerase（ Taq DNA 聚合酶）： 濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。最適濃度 50mmol/L。一般出錯(cuò)率為 2 104核苷酸 /每輪循環(huán)，利用 PCR克隆、測序時(shí)尤應(yīng)注意。富含 G和 C的序列，可適當(dāng)提高，但過高或時(shí)間過長都會(huì)導(dǎo)致酶活性損失。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。 變性后溫度快速冷卻至 40℃ ～ 60℃ ，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。 ?退火溫度與時(shí)間， 取決于 引物的長度 、 堿基組 成及其 濃度 ，還有靶基序列的長度 。但對(duì)低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加時(shí)間。 ?延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。 循環(huán)次數(shù) PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA的濃度。 六、 PCR反應(yīng)特點(diǎn) ? ： ①引物與模板 DNA特異正確的結(jié)合； ②堿基配對(duì)原則； ③ Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； ④靶基因的特異性與保守性。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣 ?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的 DNA擴(kuò)增檢測。 聚丙烯酰胺凝膠電泳：
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