核酸探針技術(shù)及應(yīng)用-文庫吧資料
2025-08-05 22:49本頁面
【正文】 n印跡法)是分析RNA(主要是mRNA)的分子雜交技術(shù)。（1）DNA 轉(zhuǎn)移雜交法(Southern印跡法)先分離DNA，經(jīng)或不經(jīng)核酸內(nèi)切酶的切割，用瓊脂搪電泳法(凝膠電泳分離)使DNA按分子量大小移動分開， 然后使凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維索膜上，再以31P標(biāo)記的DNA 探針進(jìn)行雜交。常用固相雜交技術(shù)有以下幾種。雜交結(jié)果可通過酶促化顯色法直接顯示或用儀器檢測或進(jìn)行放自顯影。均相雜交是直接將目的序列和探針在溶液中進(jìn)行雜交和檢測． 由于不需從溶液中分離出雜交體，因而使檢測周期大為縮短，是目前最簡單的雜交程序。程序越來越簡單，檢測周期越來越短，同時提高了檢測的靈敏性和準(zhǔn)確性。若為雙鏈核酸則事先需要變性， 使之打開成單鏈。目前PVCR法已廣泛應(yīng)用于DNA診斷的各種技術(shù)中，在遺傳病的產(chǎn)前診斷，傳染病的早期診斷和法醫(yī)物證鑒定中均取得了滿意的結(jié)果。如果古量太低必然會影響檢測的靈敏度。用高濃度的硫氰酸胍直接使細(xì)胞裂解，并使細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)包括核酸酶變性，釋放出核酸，使纏繞的DNA分子解纏繞，形成一個適宜直接雜交的液相環(huán)境，這樣的標(biāo)本處理方法不僅減少了工作量，而且容易掌握，國外在愛滋病的病毒檢測中已應(yīng)用這種方法對血細(xì)胞進(jìn)行處理。標(biāo)本經(jīng)快速過柱后，達(dá)到純化，DNA 加熱變性使成單鏈 (RNA是單鏈勿需予先變性)采取標(biāo)本可能是未知病原體懸液，亦可能是痰或糞便標(biāo)本等。3 標(biāo)本處理首先從標(biāo)本中提取DNA 作為靶源后方能用探針進(jìn)行檢測。當(dāng)生物素的戊酸側(cè)鏈通過酰胺鍵與其他分子相連后， 其脲基環(huán)保持與親和素之一結(jié)合的能力， 因而可通過生物素的戊酸側(cè)鏈與待測目標(biāo)相連。在這里介紹一種非放射性標(biāo)記“生物素核酸探針” ，其基本原理為：生物素(Biotin)是一種B族維生素，能與抗生素蛋白——親和素(Avidin)或鏈霉親和素(Streptavidin)特異性結(jié)合，其解離平衡常數(shù)(KD)為105 。非放射性標(biāo)記的特點是保存時問長， 檢測時使用方便，其最大缺點是靈敏度一般比放射性同位素低，但最近報道用化學(xué)發(fā)光物吖啶酯直接標(biāo)記DNA探針，用化學(xué)發(fā)光儀檢測雜交體，其靈敏度超過放射性同位素標(biāo)記的探針。因此近年來發(fā)展了非放射性標(biāo)記，用于標(biāo)記的非放射性物質(zhì)有金屬(如汞)，半抗原(如地高辛)，生物素。放射性同位素標(biāo)記的優(yōu)點是敏感度高，對被檢樣品處理要求不高，假陽性率小，且32P代替磷原予不改變堿基空間結(jié)構(gòu)，所以不影響雜交反應(yīng)的動力學(xué)曲線。2 核酸探針的標(biāo)記核酸探針過去采用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記，常用標(biāo)記物有α32P dNTP，35S dNTP等。其優(yōu)點為CDNA探針?biāo)患埃?由于RNA—RNA復(fù)合物比DNA—RNA復(fù)合物穩(wěn)定，所以其靈敏度可提高10倍以上。1．3 RNA探針有些雙鏈RNA病毒的基因組在標(biāo)記后， 可直接用作
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