轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用-文庫吧資料
2024-07-27 22:42本頁面
【正文】 還提供可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒，在質(zhì)粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉(zhuǎn)染效果。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行，但對(duì)GenEscort系列轉(zhuǎn)染試劑影響不大。（5）氮磷（N/P）比N/P比是轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵（為了換算方便，一般以DNA/轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量比表示），在一定比例范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染效率隨N/P比成比例增高，之后達(dá)到平值，但毒性也隨之而增加，因此在實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)根據(jù)推薦比例，確定本實(shí)驗(yàn)的最佳轉(zhuǎn)染比例。這可能間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染很有幫助。通常的，血清是一種包含生長(zhǎng)因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對(duì)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)作用有很大的差別。不過要特別注意：對(duì)于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。（3）血清血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后洗細(xì)胞或者在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞如原代細(xì)胞會(huì)受到損傷，甚至死亡導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊矔?huì)影響轉(zhuǎn)染時(shí)的鋪板密度，比如研究細(xì)胞周期相關(guān)基因等表達(dá)周期長(zhǎng)的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑。因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個(gè)穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等等。不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時(shí)的最適細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會(huì)因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。一定要避免細(xì)菌，支原體或真菌的污染。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度，一般的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)有專門的說明。（1）細(xì)胞培養(yǎng)物健康的細(xì)胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。3．轉(zhuǎn)染方法不同轉(zhuǎn)染試劑有不同的轉(zhuǎn)染方法，但大多大同小異。也就是說同一種系的細(xì)胞株，在各實(shí)驗(yàn)室不同培養(yǎng)條件下，其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。2．細(xì)胞狀態(tài)一般低的細(xì)胞代數(shù)（50）能確?；蛐筒蛔儭Ｃ糠N轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，通過這些資料可選擇最適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。影響轉(zhuǎn)染效率的因素有很多，細(xì)胞株本身的特性和活性，細(xì)胞培養(yǎng)條件，轉(zhuǎn)染的DNA或RNA的質(zhì)量，轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染試劑的選擇等。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。聚合物的分枝結(jié)構(gòu)使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒，從而提高轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)所形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞以后，其中所含的生理?xiàng)l件下可降解的化學(xué)鍵在細(xì)胞內(nèi)水解，使交聯(lián)聚合物分解為無細(xì)胞毒性的小分子PEI，這樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑在體外應(yīng)用可以獲得高的轉(zhuǎn)染
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