【正文】 ）尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：按以下色譜條件對尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測。m的針式濾膜過濾后備用。3）磷酸鹽緩沖液： mol/L。 181。2）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取100 mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。試劑的準(zhǔn)備1）尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取2 g尿素標(biāo)準(zhǔn)品于100 mg/mL的尿素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再分別稀釋為濃度為1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用 181。藥品：乙腈（色譜純）、磷酸二氫鉀、超純水（或用娃哈哈純凈水代替）。根據(jù)所測定的A595nm值，在(3)中制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，再乘以稀釋倍數(shù)計算出原樣品中的蛋白濃度(mg/mL)。(3)以用吸光度值A(chǔ)595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后再分別向各試管中加入5 mL的考馬斯亮藍(lán)G250溶液，每加完一管，立刻混合搖勻。從各定溶好的各樣品中分別取l mL，然后再用9 mL的蒸餾水稀釋至考馬斯亮藍(lán)法的檢測范圍內(nèi)。表25 考馬斯亮藍(lán)測定方法中牛奶中添加三聚氰胺溶液的配制樣品編號牛奶所占比例牛奶/ mL三聚氰胺溶液/ mL690%780%870%950%樣品前處理向1~6號樣品中分別加入13 mL乙腈和5 mL水，劇烈振蕩6 min，充分混勻后靜置10 min，在10000 r/min轉(zhuǎn)速下，離心20 min，去上清液，沉淀待用。表24 考馬斯亮藍(lán)測定方法中牛奶中添加尿素溶液的配制樣品編號牛奶所占比例牛奶/ mL尿素溶液/ mL1100%10290%380%470%550%2）牛奶中摻入三聚氰胺溶液的摻假樣品處理根據(jù)凱氏定氮法測得的牛奶中的氮含量配置三聚氰胺溶液，使每毫升三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量。摻雜樣品處理1）牛奶中摻入尿素溶液的摻假樣品處理根據(jù)凱氏定氮法測得的牛奶中的氮含量配置尿素溶液，使每毫升尿素溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量。表23 雙縮脲法實驗表試管號試劑123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液/mL0蒸餾水/mL 考馬斯亮藍(lán)法測定牛奶中的蛋白質(zhì)含量 考馬斯亮藍(lán)法中用到的實驗儀器及藥品與雙縮脲法中所用的儀器及藥品基本相同，需要特別用到藥品的如下所示：實驗藥品：考馬斯亮藍(lán)G250染料、85%的磷酸。2）樣品中的蛋白含量測定取9只試管并編號，1~，按照1）中的測定方法，使未知樣品測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定范圍內(nèi)。就可以開始用石英比色皿在分光光度計上測定各樣品在550 mn處的光吸收值A(chǔ)550nm，空白對照樣品為1號試管， mL水， mL6％ mL的雙縮脲試劑。 mL6%的氫氧化鈉溶液， mL的雙縮脲試劑，每加完一管，立刻混合搖勻。將上述各沉淀樣品中加入少量的水和l mol/L氫氧化鈉溶液溶解，加水定溶至50 mL待用。取不同體積的牛奶4份，以樣品1作為對照樣，樣品6~ mL、 mL、 mL、 mL的牛奶，然后向6~9號樣品中添加不同體積的三聚氰胺溶液，使得總體積都為1 mL，配制的樣品編號及含量如表22所示。取不同體積的牛奶5份，樣品1為l mL牛奶(作為摻假牛乳的標(biāo)準(zhǔn)樣品)，樣品2~ mL、 mL、 mL、 mL的牛奶，然后向2~5號樣品中添加不同體積的尿素溶液，使得總體積都為1 mL，配制的樣品編號及含量如表21所示。酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(1 mg/mL)：準(zhǔn)確稱取110 mg的酪蛋白，加水溶解定溶至100 mL即為l mg/mL標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液。置聚乙烯瓶內(nèi)蓋緊保存。5H2O）3 g，溶于 500 ml新鮮制備的蒸餾水中，加入酒石酸鉀鈉9 g，碘化鉀5 g，攪拌至完全溶解。圖21 722型光柵分光光度計實驗藥品：酒石酸鉀鈉、碘化鉀、酪蛋白（用作標(biāo)準(zhǔn)蛋白）、乙腈、6%NaOH溶液。根據(jù)所消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，計算出總的氮的含量，再乘以蛋白質(zhì)中氮的轉(zhuǎn)化系數(shù)即可得到樣品中的蛋白質(zhì)的含量。 mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定接收瓶瓶中的液體，使之剛剛出現(xiàn)灰紫色即為終點， mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）。通入蒸汽5 min，降低接收瓶位置使冷凝管末端離開液面后再繼續(xù)蒸餾1 min，用少量蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液并入接收瓶，取下接收瓶。再吸取10 mL定容后的樣品液，沿小玻璃杯移入反應(yīng)室，并用少量的蒸餾水沖洗小玻璃杯，塞緊棒狀杯塞。將消化好并冷卻至室溫的樣品溶液全部轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度搖勻。消煮好后關(guān)閉熱源讓其自然降溫。角斜放在支架上，用第2章 實驗材料及方法 電爐緩慢加熱，當(dāng)瓶內(nèi)泡沫消失后強熱至沸。1) 試樣消化。5) 混合指示劑：%的甲基紅乙醇溶液（ g甲基紅試劑溶于20 mL無水乙醇乙醇，稀釋至100 mL）20 %亞甲基藍(lán)乙醇溶液（2 g亞甲基藍(lán)定溶于100 ml無水乙醇中）10 mL混合搖勻。3) 2%的硼酸溶液：2g硼酸加蒸餾水定容至100 mL。試劑的配制1) 40%的氫氧化鈉溶液：40 g氫氧化鈉加蒸餾水定容至100 mL。 第2章 實驗材料及方法 用凱氏定氮法測定牛奶中的蛋白質(zhì)含量 實驗儀器：凱氏定氮裝置、凱氏燒瓶、冷凝管、接收瓶、燒杯、移液管、100 mL容量瓶、量筒、酸式滴定管、分析天平、電熱套、研缽、藥匙、玻璃棒、膠頭滴管、吸管、燒杯和試管若干、鐵架臺等。（3）使用雙縮脲(Lowry)法、Bradford方法對于牛奶中摻入不同比例的尿素溶液、三聚氰胺溶液樣品，樣品經(jīng)前處理后，看能否準(zhǔn)確測定牛乳蛋白含量。 課題研究的主要內(nèi)容 本課題的主要研究內(nèi)容包括以下幾個問題：（1）通過凱氏定氮法準(zhǔn)確測定牛奶中的蛋白質(zhì)的含量。由于福林酚試劑法對實驗時間要求嚴(yán)格，而實驗室的設(shè)備條件不能達(dá)到要求，所以本課題中將不再用此方法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。本研究的目的是從幾種傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)測定方法中來尋找適合乳品蛋白質(zhì)測定的方法。為此，急需建立適應(yīng)新?lián)郊偾闆r的快速、準(zhǔn)確的檢測方法。在原奶中摻雜摻假[27,28]，這種丑惡行為既影響了牛奶的品質(zhì)，又損害了消費者的健康，在社會產(chǎn)生了極大的反響。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。而反向色譜法則一般用非極性固定相（如C1C8)；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。其中，正向色譜法是采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。高效液相色譜的缺點是有“柱外效應(yīng)”。⑤應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢?？蛇x擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。②高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時。高效液相色譜法是在高壓條件下，溶質(zhì)在固定相和流動相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換的過程，它借溶質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離[26]。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。 高效液相色譜法（HPLC）高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography / HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。第三，標(biāo)準(zhǔn)曲線在蛋白質(zhì)濃度較大時有輕微的非線性,因此不能使用比爾定律直接進(jìn)行計算,而只能通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度[25]。由于不同種類的蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量分布不同,因此考馬斯亮藍(lán)法在測不同的蛋白質(zhì)時會有較大的偏差,在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用γ球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白以減少這方面的偏差[23]。除上述優(yōu)點之外，Bradford法干擾物質(zhì)少，如干擾福林酚試劑法的K+、Na+、Mg2+ 離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDAT等物質(zhì)均不會對Bradford法造成干擾[22]。完成一個樣品的測定, 只需加一種試劑，并且只需要5分鐘左右即可。這是因為蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G250染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色的變化很大,再加上蛋白質(zhì)染料復(fù)合物又有很高的消光系數(shù),因而吸光度值隨蛋白質(zhì)濃度的變化要比福林酚試劑法大的多[20]。（2）優(yōu)缺點考馬斯亮藍(lán)法的優(yōu)點在于它的靈敏度高。超過穩(wěn)定時間之后,蛋白質(zhì)染料復(fù)合物就會發(fā)生聚合并沉淀出來。通過測定在595 nm下的吸光度值A(chǔ)595nm，可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。（1）實驗原理由于考馬斯亮藍(lán)G250染料存在著兩種不同的顏色形式——棕紅色和藍(lán)色，在酸性溶液中染料與蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸和某些堿性氨基酸發(fā)生反應(yīng),使染料的最大吸收峰的位置(λmax)由465 nm變?yōu)?95 nm，溶液的顏色也由棕紅色變?yōu)樗{(lán)色。Bradford在1976年根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計而建立了考馬斯亮藍(lán)法，這種測定蛋白質(zhì)的方法具有超過其他幾種方法的突出的優(yōu)點,因而得到廣泛的應(yīng)用。需要注意的是，在進(jìn)行測定時,加入福林酚試劑時要特別小心,因為該試劑僅在酸性條件下穩(wěn)定,但上述的還原反應(yīng)只能在pH=10的情況下才可以進(jìn)行,故當(dāng)福林酚試劑加入堿性的銅蛋白質(zhì)溶液中時,必須立即混勻,以便在磷鋁酸磷鎢酸試劑在遭到破壞之前,還原反應(yīng)就能發(fā)生[15]。對雙縮脈反應(yīng)發(fā)生干擾的離子,同樣容易干擾福林酚反應(yīng)。（2）優(yōu)缺點Lowry法的優(yōu)點在于它的靈敏度高,與雙縮脲法相比，它的靈敏度要高得多。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色的原因是:在堿性環(huán)境中,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅離子結(jié)合生成復(fù)合物；福林酚試劑中的磷鋁酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產(chǎn)生深藍(lán)色(鋁藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物)。Lowry法是最靈敏的蛋白質(zhì)測定方法之一,該法在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。（Lowry法）福林酚試劑法（Lowry法）是Lowry 在雙縮脲方法的基礎(chǔ)上發(fā)展的。含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉氫氧化鈉溶液,即可顯色測定。主要的干擾有：酚類、檸檬酸、硫酸銨、Trsi緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用[14]。而且使用的試劑價廉易得，操作簡便，可測定的范圍為1～10 mg蛋白質(zhì)，適于精度要求不太高的蛋白質(zhì)含量的測定， mg以上。肽鍵是組成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與Cu2+作用生成紫紅色絡(luò)合物，且在一定條件下，顏色的深淺程度與蛋白質(zhì)的含量的關(guān)系在一定范圍內(nèi)符合比爾定律，即蛋白質(zhì)濃度隨著顏色的加深而呈增加的趨勢，且成正比關(guān)系，而顏色的變化與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無關(guān)，因此我們可以通過雙縮脲法比色的方法來測定蛋白質(zhì)的濃度，這種方法也是常用的方法之一[13]。一般分子中含有兩個氨基甲酪基（即肽鍵：CONH）的化合物與堿性銅溶液作用，就會形成紫色或藍(lán)紫色絡(luò)合物。圖12 紫色絡(luò)合物分子結(jié)構(gòu)式由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。(Biuret法)雙縮脲(H2NOC－NH－CONH2)是兩個分子脲在180 ℃左右加熱，放出一分子氨后得到的產(chǎn)物。在我國的國家標(biāo)準(zhǔn)中，凱氏定氮法測定的是總氮的含量，因此得到的結(jié)果代表的是乳品中粗蛋白的含量；而在國際標(biāo)準(zhǔn)(ISO，AOAC，IDF)中，先用三氯乙酸對樣品進(jìn)行預(yù)處理，使蛋白質(zhì)沉淀，然后再分別對沉淀中的蛋白態(tài)氮和濾液中的非蛋白態(tài)氮進(jìn)行凱氏定氮，測定的結(jié)果可真實反映乳品真蛋白的含量[12]。但是該方法操作消耗時間長,消化一個樣品至少需要2個小時,完成整個操作流程一般需要6~7個小時左右,而且在消化過程中會產(chǎn)生大量的有害氣體二氧化硫，污染工作環(huán)境,危害操作人員的身體健康。凱氏定氮法是測定待測樣品中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確的方法,也是各種蛋白質(zhì)含量測定方法的基礎(chǔ)。消化之后向消化液中加入濃堿，濃堿可以使消化液中的硫酸銨分解,游離出氨,水蒸氣將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量一定濃度的硼酸溶液中,該過程被稱為“堿化蒸餾”。凱氏定氮法（其裝置圖如下圖11）的基本原理是將含氮的有機(jī)物與濃圖11 凱氏定氮法消化、蒸餾裝置硫酸共同加熱,反應(yīng)過程中樣品中的碳、氫等元素被氧化成二氧化碳和水而逸出,有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨,并且進(jìn)一步與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，通常稱此過程為“消化”。 凱氏定氮法我國國家標(biāo)準(zhǔn)中測定食品中蛋白質(zhì)(GB/T5009．52003)[6]有2種方法:凱氏定氮法和比色法。其中分光光度法又包括：雙縮脲法，考馬斯亮藍(lán)法，福林酚試劑法、BCA法和紫外吸收法等，滴定法包括有甲醛滴定法、pH滴定法等。因此，近年來，人們發(fā)展了許多測定蛋白質(zhì)的方法。雖然這些年來我們國家一直都在不停地打假治假，但是這種摻假造假的現(xiàn)象迄今都是禁而未止，摻雜使假的情況時不時的浮出水面，乳制品的質(zhì)量安全問題也已經(jīng)引起了全社會的普遍關(guān)注。這種在牛乳中摻雜使假的行為不僅極大損害了廣大人民群眾的身體健康和切身利益，同時也大大降低消費者對乳品企業(yè)和乳品質(zhì)量的信任，甚至使政府在人民心目中的形象遭到破壞。乳制品中的摻物的種類有很多種，如：水、米湯、豆?jié){、淀粉、蔗糖、食鹽、碳酸鈉、雙氧水、電解質(zhì)溶液、牛尿、尿素、三聚氰胺、植物油、陳乳、白礬、亞硝酸鹽、硝酸鹽、洗衣粉、抗生素、化肥等[13]。過去幾十年中，乳品經(jīng)常被用作為嬰幼兒和老弱病殘孕的營養(yǎng)食品，到近些年，乳品已就成為多數(shù)人的生活必需