【正文】 曲線。根據(jù)所測定的A550nm值，在(3)中制得的標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，再乘以稀釋倍數(shù)計算出原樣品中的蛋白濃度(mg/m1)。試劑的準備考馬斯亮藍G250溶液：稱取 100mg 考馬斯亮藍 G250，溶于 50 mL乙醇中，加入 100 mL 85%的磷酸，再用蒸餾水定容到1 L，濾紙過濾。 取不同體積的牛奶5份，樣品1為l mL牛奶(作為摻假牛乳的標準樣品)，樣品2~ mL、 mL、 mL、 mL的牛奶，然后向2~5號樣品中添加不同體積的尿素溶液，使得總體積都為1 mL，配制的樣品編號及含量如表24所示。取不同體積的牛奶4份，以樣品1作為對照樣，樣品6~ mL、 mL、 mL、 mL的牛奶，然后向2~5號樣品中添加不同體積的三聚氰胺溶液，使得總體積都為1 mL，配制的樣品編號及含量如表25所示。將上述各沉淀樣品中加入少量的水和l mol/L氫氧化鈉溶液溶解，加水定溶至50 mL。實驗操作步驟1）標準蛋白曲線的繪制(1)取6支試管，編號，取出一支試管作為空白對照，然后分別向其余的5支試管中準確的加入0 mL， mL， mL， mL， mL， mL濃度為l mg/mL標準蛋白質(zhì)溶液， mL，其添加方法及順序如表26所示。(2)經(jīng)充分混合后在室溫下放置2~5 min后就可以開始用石英比色皿在分光光度計上測定各樣品在595 mn處的光吸收值A(chǔ)595nm，空白對照樣品為1號試管， mL水，5 mL考馬斯亮藍G250溶液。表26 考馬斯亮藍法實驗表試管號試劑123456標準蛋白溶液/mL0蒸餾水/mL2）樣品中的蛋白含量測定取9只試管并編號，1~，按照1）中的測定方法，使未知樣品測定值在標準曲線的測定范圍內(nèi)。 儀器：高效液相色譜儀（如圖21所示）、一次性注射器、針式濾膜、精密PH試紙。注：在本方法中所用的水均為超純水。m的針式濾膜過濾，濾液待用。再將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋得到的濃度為5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL 的標準工作液。m的針式濾膜過濾，濾液待用。 g磷酸二氫鉀（ g），加800 mL水使其完全溶解后，再用磷酸調(diào)節(jié)為pH=，用水稀釋至1L， 181。樣品前處理稱取5 mL牛奶樣品，置于50 mL具塞刻度試管中，加入30 mL乙腈，劇烈振蕩6 min后加水定容至滿刻度，充分混勻，靜置3 min，用一次性注射器吸取上清液用針式過濾器( μm)過濾后，作為高效液相色譜分析用試樣。色譜條件： 色譜柱：ZORBAX300SBC18色譜柱（250 mm mm，5 μm） 檢測器：紫外檢測器 流動相：乙腈：水=5：95 (體積比) 檢測波長：220 nm 流速：1 mL/min 柱溫：室溫 進樣體積：10 μL在上面的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后注入尿素標準系列溶液，記錄色譜峰面積，以尿素溶液的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。色譜條件：色譜柱：ZORBAX300SBC18色譜柱（250 mm mm，5 μm）檢測器：紫外檢測器 流動相：磷酸鹽緩沖液：乙腈=70：30 (體積比) 檢測波長：240 nm 流速：1 mL/min 柱溫：40 ℃ 進樣體積：10 μL在上面的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后注入三聚氰胺標準系列溶液，記錄色譜峰面積，以三聚氰胺溶液的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。取已知三聚氰胺或尿素含量的牛奶樣品，對應(yīng)的加入一定量的標準儲備液，按“樣品前處理” 操作，平行制備3份，得到樣品溶液后按上述色譜條件對應(yīng)的進行進樣分析。根據(jù)公式：其中： c= mol/ LF= m=5 g代入上式可得到三組數(shù)據(jù)，如表32所示表32 凱氏定氮法的計算結(jié)果組號123實測值/ g/100mL平均值/ g/100mL第3章 實驗結(jié)果與分析 g/100mL。因此，凱氏定氮法適合用于測定樣品的總的氮含量。由于蛋白質(zhì)中氮元素的平均質(zhì)量分數(shù)為16%，又通過計算可知，尿素（CO(NH2)2）%，三聚氰胺(C3N3(NH2)3)%。，測得的數(shù)值如表33所示。根據(jù)上述數(shù)據(jù)作蛋白質(zhì)含量吸光度圖，得到雙縮脲法測得的酪蛋白標準曲線，如圖31所示。實驗數(shù)據(jù)及處理）中的方法用722型光柵分光光度計進行測各摻入不同比例的尿素溶液的未知樣品溶液在550nm處的吸光度值A(chǔ)550nm，測得的數(shù)值如表34所示。樣品體積（mL）計算可得雙縮脲法測定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質(zhì)的含量，如表35所示。由此看來，使用雙縮脲法測定摻入尿素的牛奶樣品的方法基本準確，但是該法測得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性一般，因此需要通過多次重復實驗得到多組數(shù)據(jù)求平均值才可以得到比較準確的結(jié)果。表36 雙縮脲法測得的添加三聚氰胺溶液的樣品在550nm處的吸光度值A(chǔ)550nm試管編號16789吸光度值A(chǔ)550nm表37 雙縮脲法測定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質(zhì)含量樣品號實測值/ g/L平均值/ g/L理論值/ g/L誤差率/ %RSD/%16789以根據(jù)表36中測得的樣品的吸光度值在圖31所示的標準曲線上查出對應(yīng)的蛋白質(zhì)含量(mg)，代入下式：蛋白質(zhì)含量（mg/mL）=標準曲線上查得的蛋白質(zhì)含量（mg/mL)50(mL)247。結(jié)果分析%、%、%、%，%、%、%、%。 考馬斯亮藍法的實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計算，使每毫升尿素溶液和三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量的方法對樣品進行摻雜。 g/100mL， g/100mL， g/100mL。表38 考馬斯亮藍法測得的標準酪蛋白溶液在595nm處的吸光度值A(chǔ)595nm蛋白質(zhì)含量/ 100μg/mL0吸光度值A(chǔ)595nm000其對應(yīng)蛋白質(zhì)含量的吸光度的平均值分別為：0、。圖32 考馬斯亮藍法測得的酪蛋白標準曲線圖32所示，考馬斯亮藍法以酪蛋白為標準蛋白，由所繪制的標準曲線可知，其線性方程為Y=－，相關(guān)系數(shù)為R2=，這表明酪蛋白與考馬斯亮藍G250試劑的線性關(guān)系好，因此可知考馬斯亮藍法所需的標準蛋白可以用酪蛋白。以根據(jù)表39中測得的樣品的吸光度值在圖32所示的標準曲線上查出對應(yīng)的蛋白質(zhì)含量(mg)，代入下式：蛋白質(zhì)含量（mg/mL）=標準曲線上查得的蛋白質(zhì)含量（μg/mL) 500(mL) 247。表39 考馬斯亮藍法測得的添加尿素溶液的樣品在595nm處的吸光度值A(chǔ)595nm試管編號12345吸光度值A(chǔ)595nm結(jié)果分析%、%、%、%,%、%、%、%。表310 考馬斯亮藍法測定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質(zhì)含量樣品號實測值/ g/L平均值/ g/L理論值/ g/L誤差率/ %RSD/%12345 考馬斯亮藍法對摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定實驗數(shù)據(jù)及處理同理可得用722型光柵分光光度計進行測各摻入不同比例的三聚氰胺溶液的未知樣品溶液在595nm處的吸光度值A(chǔ)595nm，測得的數(shù)值如表311所示。 [樣品體積（mL）1000]表311 考馬斯亮藍法測得的添加三聚氰胺的未知樣品在595nm處的吸光度值A(chǔ)595nm試管編號16789吸光度值A(chǔ)595nm計算可得考馬斯亮藍法測定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質(zhì)的含量，如表312所示。由此看來，使用考馬斯亮藍法測定摻入三聚氰胺的牛奶樣品的方法與理論差值的誤差比較大，但是該法測得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，因此該方法可以不通過進行多次重復實驗就可以得到結(jié)果。 反向高效液相色譜法的實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 尿素標準曲線和三聚氰胺標準曲線的繪制尿素標準曲線使用高效液相色譜儀，））所處理好的不同濃度的尿素標準溶液進行進樣檢測，測得的峰面積如表313所示。以濃度為橫軸，峰面積為縱軸，作尿素標準曲線圖，如圖33所示。三聚氰胺標準曲線使用高效液相色譜儀，））所處理好的不同濃度的三聚氰胺標準溶液進行進樣檢測，測得的峰面積如表314所示。以濃度為橫軸，峰面積為縱軸，作三聚氰胺標準曲線圖，如圖34所示。重現(xiàn)性由表313和314中的數(shù)據(jù)，分別以5 mg/mL尿素和25 μg/mL三聚氰胺標準溶液為例，其中，5 mg/，%，25 μg/，%。圖35 尿素與純牛奶與摻入尿素的純牛奶的高效液相色譜圖用高效液相色譜儀對純牛奶和純牛奶中添加10 mg/mL、15 mg/mL尿素溶液的樣品樣品分別進行進樣檢測。但是從理論上來講，純的牛奶中應(yīng)不含尿素或含有少量尿素，尿素峰的位置應(yīng)基本不出峰或出很小的峰。因而未能用標添法測出牛奶中的尿素的含量。圖36 三聚氰胺與純牛奶與摻入三聚氰胺的純牛奶的高效液相色譜圖用高效液相色譜儀對純牛奶樣品和純牛奶中添加25 μL/mL、50 μg/mL三聚氰胺溶液的樣品分別進行進樣檢測，、。由圖可知，在添加的三聚氰胺濃度為零時， μg/mL， μg/mL。圖37 標添三聚氰胺后的樣品的濃度峰面積圖結(jié)果分析用反相高效液相色譜法對牛奶中的尿素和三聚氰胺的測定的結(jié)果顯示，測兩種標準品的結(jié)果的相對標準偏差都很小，所以該法的重現(xiàn)性很好，也可以準確快速的測出樣品中的三聚氰胺的含量。究其原因，可能是樣品中含有的某種蛋白質(zhì)尿素的色譜峰的位置很相近，從而導致兩峰無法分開而重疊的現(xiàn)象。 燕山大學里仁學院畢業(yè)設(shè)計（論文） 結(jié)論本文采用常量凱氏定氮法，雙縮脲法，考馬斯亮藍法以及反相高效液相色譜法分別對牛奶以及摻入尿素和三聚氰胺的牛奶樣品進行實驗分析。因此，凱氏定氮法適合用于測定樣品的總的氮含量?？捡R斯亮藍法理論測定值應(yīng)比雙縮脲法的靈敏度和準確性都高，但實驗中測得的結(jié)果不如雙縮脲法得出的結(jié)果準確，因牛奶中的某些蛋白在酸性條件下會析出而導致吸光度降低，所以用考馬斯亮藍法實際測的過程中要盡量避免過酸的環(huán)境。而且定性分析結(jié)果也很好。綜上所述，測定樣品中總的氮含量時使用凱氏定氮法較好，要測定樣品中的蛋白質(zhì)含量時用雙縮脲法或考馬斯亮藍法都可以簡便快速準確的得出結(jié)果，對樣品中的雜質(zhì)的定性分析時用反相高效液相色譜法更簡便快捷準確。學刊．2008(1)：8l83[6] 食品中蛋白質(zhì)的測定[S]．GB/T5009．5200[7] 大連輕工業(yè)學院，華南理工大學，鄭州輕工業(yè)學院等．食品分析[M]．北京：中國輕工業(yè)出版社，2004，214232[8] 張慧玲．凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的改進[J]．科技資訊．2009，25(1)[9] 黃曉東．降低凱氏定氮法操作誤差的一些途徑[J]．山西食品工業(yè)．1995，(1)：3536[10] 徐亞麥，劉鑫．奶粉中蛋白質(zhì)含量測定方法的改進[J]．中國乳業(yè)．2010，(1)：5960[11] 雷彩霞．凱氏定氮法測定粗蛋白應(yīng)注意的幾個問題[J]．西部糧油科技．2003，(1)：6264[12] Peterson G. 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