【正文】 托利多儀器（上海）有限公司 722光柵分光光度計 上海精密科學儀器有限公司 XSZ2GA光學顯微鏡 重慶光電儀器有限公司 13 菌種的鑒定 2． 2． 2． 1 形態(tài)特征 （ 1） 菌落特征 將菌接種于牛肉膏平板培養(yǎng)基上， 32℃ 恒溫培養(yǎng) 48h，觀察菌體和菌落 [21]。 12 表 試劑 Table The reagents 試劑名稱 生產(chǎn)廠家 牛肉膏、蛋白胨 梁山科泰生物制品有限公司 葡萄糖、蔗糖 廣東汕頭市西隴化工廠 瓊脂條 福建省石獅市瓊脂副食品加工廠 對二甲氨基苯甲醛、 FeSO 對硝基苯酚 天津市博迪化工有限公司 KH2PO4 、 Na2MoO4， CaSO4 2天后，挑取有明顯透明圈的菌落劃線轉(zhuǎn)移至農(nóng)藥濃度提高的新鮮富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 2天，連續(xù) 5次轉(zhuǎn)接直至富集培養(yǎng)基中農(nóng)藥濃度提高到 480mg/L。 試劑如表 主要儀器 及設(shè)備 主要儀器及設(shè)備如表 試驗方法 菌種的分離及篩選 采用固體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)法，稱取土樣 1 g于 5mL無菌水中振蕩混勻制成菌液。 選擇培養(yǎng)基 (瓊脂平板 )：在富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入 100mg/L的毒死蜱。2H2O ， FeSO47H2O 0. 2g ， CaSO4 (2)真菌：馬鈴薯 200g，葡萄糖 20g，瓊脂 1520g，蒸餾水 l000 ml，自然 pH[21]。表 [20]為部分菌種和其能夠降解的農(nóng)藥。 降解有機磷農(nóng)藥的微生物種類 綜述有關(guān)文獻發(fā)現(xiàn) [18,19]： (1)能夠降解農(nóng)藥的有 細菌，真菌，放線菌藻類，其中，細菌本身在生理生化具有多種適應(yīng)能力以及容易誘發(fā)突變，因此，這使得細菌在降解農(nóng)藥中占主導地位。這是目前世界上還未有商品化生產(chǎn)的有機磷農(nóng)藥降解酶產(chǎn)品以及在生產(chǎn)實踐上推廣應(yīng)用的關(guān)鍵原因。 應(yīng)用有機磷農(nóng)藥降解酶就必須解決一個關(guān)鍵性的問題 ——如何工業(yè)化、廉價、快速生產(chǎn)有機磷農(nóng)藥降解酶。陳亞麗 (2020)[14]等從一株假單胞桿菌 WBC3 中分離到降解甲基對硫磷的有機磷農(nóng)藥降解酶，已進行 X－衍射分析其三維結(jié)構(gòu)。李順鵬等 (2020) [13]分離了多株有機磷降解菌，并對其進行了詳細研究，分離獲得了多種有機磷農(nóng)藥降解酶的基因，實現(xiàn)了融和表達，并對酶學性質(zhì)進行了分析。這些研究使得關(guān)于有機磷農(nóng)藥降解酶的認識得到進一步深入，酶學機理得到進一步了解。與 OPH 相比， OPDA 降解二甲基底物的速度更快，但對于二乙基底物的水解速度無關(guān)。 Munnecke 等分離到的有機磷農(nóng)藥降解酶對試驗用的甲基對硫磷、對硫磷、二嗪農(nóng)、毒死蜱等 7 種有機磷農(nóng)藥均能有效降解，在 22℃ 時降解效率比化學降解快 10002450 倍，且該酶不為農(nóng)藥及農(nóng)藥制劑中溶劑所抑制，對環(huán)境條件有較寬的忍受范圍。 通過底物類似物親和晶體的 x－衍射的方法，國外的學者們研究了酶的三維構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)酶是同源二聚體，其催化中心具有 2 個 Zn2+離子，它們?yōu)槊傅膸讉€重要的氨基酸殘基（ His55,His57,Lys169,Asp301,His201,His230）所圍繞，形成雙核金屬催化中心，在這里金屬離子結(jié)合的羥離子可以親核攻擊底物的親核性磷原子，促進水解反應(yīng)的發(fā)生，從而使農(nóng)藥毒性降低。其中兩株對硫磷降解菌 Flavobacterium (Walter ,1980)和 Pesudomonas diminuta GM( McDaniel,1988)的降解酶得到了深入細致的研究，分離得到了降解酶基因（ opd），比較發(fā)現(xiàn)兩者基因具有很強的同源性，并且這兩株菌的降解酶基因都定位于細菌內(nèi)的大質(zhì)粒上。因此，人們的思路從應(yīng)用微生物菌體凈化農(nóng)藥污染轉(zhuǎn)向利用有機磷農(nóng)藥降解酶。進一步研究發(fā)現(xiàn)這些微生物之所以能降解有機磷農(nóng)藥是因為它們能分泌一 種能水解磷酸酯鍵的酶，即后來研究的有機磷農(nóng)藥降解酶。 8 有機磷農(nóng)藥微生物降解的研究進展 自上世紀 70 年代開始，人們就發(fā)現(xiàn)有些土壤微生物對有機磷農(nóng)藥具有降解作用。一種有機磷農(nóng)藥可被多種微生物降解；同時，一種微生物也可對多種有機磷農(nóng)藥進行降解。而當農(nóng)藥濃度過低時，由于微生物生長的碳、氮源不足，抑制了微生物的生長，從而抑制有機磷農(nóng)藥的微生物降解，實驗證實樂果濃度在 %時微生物降解的效果最好，而在 %和%則呈下降趨勢。這可能是因為當有機磷農(nóng)藥開始加人土壤后，農(nóng)藥的濃度高對土壤中微生物生長和活動產(chǎn)生抑制作用，從而 對微生物體內(nèi)酶和土壤中的游離酶產(chǎn)生抑制作用，但有機磷農(nóng)藥能促進土壤中一些微生物 (如細菌、真菌和放線菌等 )的生長并抑制一些微生物 (如固氮菌 )的生長，所以隨著細菌、真菌和放線菌數(shù)量的增多以及農(nóng)藥濃度的減少，酶的活性也就提高了。有機磷農(nóng)藥對土壤中的活性酶也存在抑制性，抑制程度的大小隨著外界環(huán)境的變化而變化，而且 不同種類的有機磷農(nóng)藥對酶的影響也是不同的，但反過來，有機磷農(nóng)藥對酶的活性也具有一定的刺激作用，朱南文等 (1996) [11]發(fā)現(xiàn)在施用甲胺磷 14d 內(nèi)，甲胺磷對土壤中酸性磷酸酶、中性磷酸酶和堿性磷酸酶呈一定的抑制作用，而在 4d 以后，對酶的抑制性消失，甚至出現(xiàn)了刺激效應(yīng)。Bello Ramirez A M(2020) [9]等也證實氯代過氧化物酶可以切斷有機磷農(nóng)藥中的PS 鍵。當有機磷農(nóng)藥進人土壤環(huán)境，土壤中的微生物產(chǎn)生相應(yīng)的酶，在這些酶的作用下，上述化學鍵被打斷，使有機磷農(nóng)藥被降解。 YonezawwaY(1979)[8]等認為當微生物對有機化合物的降解作用是由其細胞內(nèi)的酶引起時，微生物降解的整個過程可以分為三個步驟 ： 首先是化合物在微生 7 物細胞膜表面的吸附，這是一個動態(tài)平衡 ； 其次是吸附在細胞膜表面的化合物進入細胞膜內(nèi)，在生物量一定時，化合物對細胞膜的穿透率決定了化合物穿透細胞膜的量 ； 最后是化合物進入微生物細胞膜內(nèi)與降解酶結(jié)合發(fā)生酶促反應(yīng)，這是一個快速的過程。 有機磷農(nóng)藥的微生物降解 微生物及其降解酶的降解作用是環(huán)境中有機磷農(nóng)藥分解與轉(zhuǎn)化的重要途徑，利用微生物及其產(chǎn)生的降解酶進行土壤和水體中化學農(nóng)藥的去毒與凈化是治理化學農(nóng)藥污染的有效方法 [8]，并已顯示出良好的應(yīng)用前景。與其它的微生物相比，細菌具有適應(yīng)外界環(huán)境能力強和容易發(fā)生突變，因此，這些特點決定了細菌在降解農(nóng)藥方面占有不可替代的位置。 生物降解 生物降解就是通過生物 (包括各種微生物、植物和動物 )的作用將大分子分解成小分子化合物的過程 [1]。 6 光學降解 農(nóng)藥經(jīng)過太陽光或者紫外線的照射后，那些比較脆弱的化學鍵發(fā)生斷裂，因此，形成了特別活潑的中間產(chǎn)物 (自由基 )，隨后，自由基和溶劑或者其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，便得到了光解產(chǎn)物。并伴有強烈的沖擊波和時速高達 400Km/h 的射流，在這樣的極端環(huán)境下，泡內(nèi)氣體和液體交界面的介質(zhì)被加熱，同時分解產(chǎn)生強氧化性的自由基 [5]。OH 等 )來降解農(nóng)藥的。 超聲波誘導降解法 超聲誘導降解農(nóng)藥的原理：通過強氧化性的自由基 ( 過氧化氫法：以過氧化氫為氧化劑來降解農(nóng)藥，其降解產(chǎn)物和通過臭氧方法得到的反應(yīng)產(chǎn)物一樣。其化學特性為強氧化性質(zhì)，因此具有消毒，除臭，殺菌，等多種功效，特別是臭氧與蔬菜、水果中殘留的有機磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥發(fā)生氧化還原反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為其相應(yīng)的酸、醇、胺或其氧化物等，這些反應(yīng)產(chǎn)物大都是水溶性的物質(zhì)，最后可以用水沖走一些有機磷農(nóng)藥，因此，農(nóng)藥殘留通過臭氧降解是安全可行的。下面主要介紹前兩種方法。 環(huán)境中有機磷農(nóng)藥的降解方法 環(huán)境中殘留農(nóng)藥的消除方法主要有化學降解，光化學降解，超聲波，電離輻射，生物降解等 [3]。而在污染治理的實踐中，高效，無二次污染，以及低成本的生物降解越來越體現(xiàn)出了應(yīng)用的優(yōu)勢。農(nóng)藥在治理病蟲害，提高糧食產(chǎn)量方面發(fā)揮著不可低估的作用 ； 每年的化學農(nóng)藥除了銷售本身所得的效益外，通過 防治病蟲害為人類挽回了數(shù)以億萬斤計糧棉的間接效益，對世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的持續(xù)、穩(wěn)定、高產(chǎn)起了關(guān)鍵的作用。 有機磷農(nóng)藥的這些特性無疑增加了人們的認識，對某些高毒性農(nóng)藥使用的限制已經(jīng)日益法制化。低毒有機磷品種辛硫磷經(jīng)光解也生成對哺乳動物毒性較大的硫代特普。有機磷農(nóng)藥的毒性除受農(nóng)藥自身性質(zhì)影響外，制劑中的某些毒性物質(zhì)，代謝過程中的中間體及降解產(chǎn)物也會使農(nóng)藥的毒 性大增。 1983 年有機氯農(nóng)藥被禁止使用后，有機磷農(nóng)藥由于其半衰期一般在幾周至幾個月，被認為在環(huán)境中降解快、殘留期短而發(fā)展很快。國內(nèi)外文獻顯示，二十世紀八十年代以來，每年大約 3107公斤的有機磷農(nóng)藥被大量使用，導致每年有數(shù)千例農(nóng)藥中毒事件發(fā)生，直接死 亡數(shù)為 800 余人。 有機磷農(nóng)藥毒性很高，有機磷中毒在我國比較多見。土壤中的農(nóng)藥殘留導致土壤中的生物多樣性相對降低，多種種類的生物減少，土質(zhì)降低，生產(chǎn)能力下降。(3)農(nóng)藥工業(yè)廢水的排放和意外泄漏都會造成對環(huán)境的污染。研究表明有機磷農(nóng)藥在農(nóng)田施用時，只有 1%～ 2%的農(nóng)藥作用于害 蟲或病菌，還有 10%～ 20%的農(nóng)藥附著在農(nóng)作物的表面，其余的農(nóng)藥會直接進入環(huán)境，污染土壤、水和空氣，同時破壞了整個生態(tài)平衡 。 所謂農(nóng)藥環(huán)境污染，是由于人類活動直接或間接地向環(huán)境中排入了超過其自 凈能力的農(nóng)藥，使環(huán)境的質(zhì)量降低，以致影響人類及其他環(huán)境生物的安全。 有機磷農(nóng)藥的危害 農(nóng)藥環(huán)境污染造成的損失是多方面的。 有機磷農(nóng)藥含有三個磷酯鍵，被稱為磷酸三酯，根據(jù) P 可與 O 或 S 形成雙鍵，按化學鍵又可分為兩種類型，一種是 P 通過雙鍵與 O 結(jié)合，形成磷氧雙鍵（ P=O），此類農(nóng)藥有甲胺磷、氧化 樂果、敵敵畏等 。有機磷農(nóng)藥結(jié)構(gòu)通式為 : 式中， R1 、 R2 在我國目前生產(chǎn)的品種中多為甲氧基 (CH3O)或乙氧基 (C2H5O)；X 為氧 (O)或硫 (S)原子 ； Z 為烷氧基、苯氧基或其他更為復雜的取代基團。按其用途可分為殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、生長 調(diào)節(jié)劑、誘殺劑、驅(qū)蟲劑等 6 大類。 有機磷農(nóng)藥的性質(zhì)及分類 有機磷農(nóng)藥除少數(shù)品種為固體 (如樂果、敵百蟲 )外，多數(shù)為油狀液體，工業(yè)品呈淡黃色至棕色，具有大蒜樣特殊臭味。即有機磷殺蟲劑占整個殺蟲劑市場的三分之一以上。但從有機磷農(nóng)藥發(fā)展的整體趨勢而言，有機磷仍是當今農(nóng)藥的主要類別之一，它幾乎遍及農(nóng)藥的所有領(lǐng)域。世界上大型的農(nóng)藥研究開發(fā)公司終止有機磷殺蟲劑的創(chuàng)新性研究，一方面是由于一些高毒的有機磷殺蟲劑在發(fā)展上受到生態(tài)環(huán)境的制約，但更重要的原因是由于有機磷殺蟲劑開發(fā)的歷史長、品種多，已形 2 成一個比現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的 AChE 任何一類殺蟲劑在數(shù)量上都龐大的多的結(jié)構(gòu)類型，要成功 開發(fā)一個比現(xiàn)有數(shù)量眾多的有機磷殺蟲劑活性更高，成本更低的新型殺蟲劑的幾率已很小，如果在效果相同即使成本也相同情況下一個有機磷酸酯類新品種要取代已有穩(wěn)定市場的廉價的有機磷農(nóng)藥老品種，也需經(jīng)過一個長期的艱難的時期。 1930～ 1985 年有 147 個有機磷化合物被發(fā)現(xiàn)，并由 29 個公司開發(fā)，其中 35%的化合物都由 Bayer 公司開發(fā)，前 50個品種的開發(fā)的時間，每個約需 2～ 3 年，成本也相當便宜，后來的每個品種開發(fā)的時間至少為 6 年，開發(fā)費不斷上漲。至今為止，有機磷農(nóng)藥超過了 300 種。在有機磷農(nóng)藥的發(fā)展歷程中，不僅充分體現(xiàn)了它們具有經(jīng)濟和商業(yè)上的重要價值，而且為有機磷農(nóng)藥化學帶來了許多創(chuàng)新的機遇，同時隨著研究的深入，也引發(fā)了許多科學上的爭論。 growth condition 1 第一章 文獻綜述 有機磷農(nóng)藥概述 發(fā)展簡史 回顧世界農(nóng)藥的發(fā)展史，有機磷農(nóng)藥可以說是最重要的一類農(nóng)用化學品，它們在農(nóng)業(yè)和商業(yè)上發(fā)揮了巨 大的作用，但始終保持著相對低廉的價格 [1]。 Fungal growth will augment with the increase of carbon concentration. They can multiply more when the pH value is from 6 to 8. And they will reach their maximum value as the temperature is 30 ℃ . When the pesticide’s concentration is not so high, it has little effect to strain. In the degradation of strain, the extent of fungus’ growth conditions is wider than that of bacteria, and fungus’ application prospect is better. Keyword: Organophosphate 。 關(guān)鍵詞 :有機磷；降