【正文】 ................................... 25 總結(jié) ................................................................................................................ 25 展望 ................................................................................................................ 25 致 謝 ................................................................................................................... 29 I 摘 要 本文的研究目的是 篩選出對毒死蜱 具有良好降解作用的菌株，并對其生長條件進(jìn)行研究， 為利用微生物進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥土壤修復(fù)提供理論依據(jù)。 本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 題目： 毒死蜱 降解微生物的篩選及其生長條件的研究 學(xué)生姓名 學(xué) 號 2020208149 指導(dǎo)教師 院 系 化工學(xué)院 專 業(yè) 生物工程 年 級 06 級 教務(wù)處制 二 〇 一 〇 年六月 成績 誠信聲明 本人鄭重聲明：本人所呈交的畢業(yè) 論文（設(shè)計(jì)） ，是在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。 特此聲明。 經(jīng)鑒定， 3株細(xì)菌 均為假單胞菌屬 (Pesudomonas)， 2株真菌均為 鐮孢霉屬( Fusarium LK. ex Fx)。Glucose can promote the growth of bacteria, pesticides are not high when the concentration of bacteria growth was not, bacteria optimum pH was ~ , the optimal temperature was 37 ℃ 。在有機(jī)磷農(nóng)藥的歷史發(fā)展中，以有機(jī)磷殺蟲劑為代表的祥光有機(jī)磷酸酯類化學(xué)、生化、毒性研究的數(shù)以千計(jì)的專利、論文以及大量的雜志、評論、書籍不斷發(fā)表，涉及了大量的化學(xué)家和生物化學(xué)家。商品化有機(jī)磷殺蟲劑開發(fā)的鼎盛時期是 1950～ 1965 年。因此，如果繼續(xù)開發(fā)這類有機(jī)磷殺蟲劑，將會承受更大的風(fēng)險。如果再加上有機(jī)磷除草劑（如草甘膦、草銨膦等），則更為引人注目，可見有機(jī)磷農(nóng)藥在世界農(nóng)藥市場中仍具有舉足輕重的地位。按其化學(xué)基團(tuán)可分為磷酸酯類、硫代磷酸酯類、類硫代磷酸酯類、硫代磷酸胺類等。另一種是 P 通過雙鍵與 S 結(jié)合，形成磷硫雙鍵 (P=S)，如對硫磷、甲基對硫磷、辛硫磷、毒死蜱等。有機(jī)磷農(nóng)藥污染環(huán)境的途徑主要有三個 :(l)田間的正常施用。 有機(jī)磷農(nóng)藥施用，破壞了自然界天敵與害蟲之間的生態(tài)平衡，導(dǎo)致天敵數(shù)量急劇下降及抗藥性害蟲數(shù)量增加，這樣就得再次加量使用農(nóng)藥，造成惡性循環(huán)。該類農(nóng)藥化學(xué)結(jié)構(gòu)的共性是均具有一個五價磷原子，中毒機(jī)理是磷原子與乙酰膽堿酯酶（ AChE）共價結(jié)合形成磷酰化酶，從而阻斷了乙酰膽堿的水解，乙酰膽堿在神經(jīng)系統(tǒng)中的積累引起突觸的過渡興奮，抑制神經(jīng)沖動傳導(dǎo)，引起一系列神經(jīng)綜合癥，因此對于人 4 畜可造成極大危害。但后來的研究發(fā)現(xiàn)，這些所謂的非持久性農(nóng)藥在某些環(huán)境條件下也會有較長的殘留期，并在動物體內(nèi)產(chǎn)生蓄積作用。還有些有機(jī)磷農(nóng)藥的某些降解產(chǎn)物具有潛在的致毒性，如敵敵畏水解生成二氯乙醛可能誘發(fā)突變。于是，在合理使用化學(xué)農(nóng)藥的前提下，如何減少，消除化學(xué)農(nóng)藥污染成為日益迫切的任務(wù)。 化學(xué)降解 化學(xué)降解農(nóng)藥大多是通過氧化作用來進(jìn)行，主要有臭氧法，過氧化氫法，超臨界水氧化法等。章維華等進(jìn)行了通過臭氧來降解大白菜中殘留的農(nóng)藥 [4]。O， 鐘愛國進(jìn)行了用超聲波誘導(dǎo)來降解甲胺磷的實(shí)驗(yàn) [6]。一般，能夠降解農(nóng)藥的微生物為細(xì)菌，真菌，放線菌及藻類等。 有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物降解途徑 有機(jī)磷農(nóng)藥被微生物降解是它們在土壤中轉(zhuǎn)化的重要途徑，有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物降解主要存在以下過程 ： 一種是微生物本身含有可降解該農(nóng)藥的酶系基因，當(dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)人土壤后，微生物馬上能產(chǎn)生降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解酶，在這種情況下，降解菌的選育較為容易 ； 另一種是微生物本身并無可降解該有機(jī)磷農(nóng)藥的酶系 ，當(dāng)農(nóng)藥進(jìn)人環(huán)境以后，由于微生物生存的需要，微生物的基因發(fā)生重組或改變，產(chǎn)生新的降解酶系。 Mageong(1994)[8]等報道大腸桿菌產(chǎn)生的磷酸三酯酶能打開甲胺磷的 PS鍵。郭明等 (2020) [12]發(fā)現(xiàn)在 7d 以內(nèi)，氧化樂果和久效磷對土壤中的脫氫酶產(chǎn)生抑制作用，在 9d以后，對脫氫酶的抑制作用消失，反而有一定的激活作用。王永杰等 (1999) [13]也推斷在自然環(huán)境中，有機(jī)化合物的濃度極低可能是限制其生物降解的一個主要因素。到目前為止已發(fā)現(xiàn)的有機(jī)磷降解微生物包括細(xì)菌、真菌、放線菌和藻類。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的研究目前已進(jìn)入到分子水平，數(shù)種微生物來源的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶已得到分離純化并進(jìn)行了較深入的生理生化研究。 最近又有報道， 的 opd 基因兩側(cè)基因簇有轉(zhuǎn)座子特性。 2020 年， 等 ( ,2020)從澳大利亞分離到一株降解乙硫磷的微生物，分 9 離提純了降解酶，并對它的酶動力學(xué)進(jìn)行了初步研究。從菌株 M6 中分離提純的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，其 C－末端含有 6 個寡聚組氨酸，水解甲基對硫磷時，最適 ，最佳反應(yīng)溫度 15℃ ； Mn2+、 Zn2+、Cu2+可使酶活性增加 15％－ 20％， Ca2+、 Mg2+微弱的促進(jìn)酶的作用， Ni2+對酶活性幾乎無影響； 1mmol/+ 幾乎不影響酶的 活性，而 10mmol/L +對甲基對硫磷水解酶有較強(qiáng)的抑制作用。有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶在原始天然菌株中含量太低，難以進(jìn)行大量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本昂貴。 (2)同樣的菌株能夠降解不同的農(nóng)藥，一種農(nóng)藥同時可以被不同菌株降解。 無機(jī)鹽培養(yǎng)基 : K2HPO4 0. 2g， KH2PO4 0. 8g ， MgSO47H2O 0. 005g ， (NH4)2SO4 1. 0g ， 蒸餾水 1000mL,調(diào)節(jié) 。將上述菌液分別均勻地涂布在細(xì)菌和真菌固體富集培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中毒死蜱的濃度為 60mg/L，置于 30℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2H2O 西安化學(xué)試劑廠 MgSO4用水洗去多余染液。培養(yǎng)數(shù)天后，將蓋玻片取出倒放在加封片液的載玻片上鏡檢。 (3) 明膠液化 每支試管裝 5mL 明膠培養(yǎng)基 (牛肉膏 3g，蛋白胨 5g， NaCl 5g，明膠 150g，蒸餾水 1000mL， ～ )，滅菌 15min。如菌已生長，且明膠培養(yǎng)基凝塊在 20℃ 下已部分或全部變成可流動的液體，為明膠水 解陽性．若菌已長出，而明膠表面無凹陷為穩(wěn)定的凝塊，則為明膠水解陰性。用接種環(huán)挑少量的菌苔制成懸液，于已保溫過夜的平板培養(yǎng)基上接種，適溫下培養(yǎng)。如菌苔周圍和菌苔下的培養(yǎng)基顯藍(lán)色，則為陰性反應(yīng)。若顏色不明顯可滴加 45 滴乙醚至培養(yǎng)基中，搖動，使得乙醚分散與液體中，將培養(yǎng)液靜置片刻，待乙醚浮至液面后再加試劑。陽性者斜面上有菌落生長，并且培養(yǎng)基由綠色轉(zhuǎn)為藍(lán)色，否則為陰性。檢驗(yàn)使用無菌移液管，按無菌操作法吸入到 2 毫升清潔 試管中，加入 M． R．試劑 1 滴，搖勻，呈紅色者為陽性，顯黃色者為陰性反應(yīng)。置于 4850℃ 的水浴鍋中 2 小時，或37℃ 溫度中 4 小時，呈紅色者為陽性反應(yīng)。培養(yǎng)前用牛皮紙和棉紗線將試管上的棉塞包扎好，以免雜菌順濾紙條與試管問的空隙浸入試管內(nèi)，引起染菌。于適溫下培養(yǎng)，適溫培養(yǎng)幾天，觀察如果是兩管內(nèi)均產(chǎn)酸或皆產(chǎn)酸又產(chǎn)氣者即為發(fā)酵產(chǎn)酸。滅菌。 碳源濃度對菌種生長的影響試驗(yàn)：將菌種在含有農(nóng)藥的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，制成種子液，按 10%的接種量接于含 300mg/L的毒死蜱的無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，分別以 、 、 1g/L、 5g/L、 10g/L濃度的葡萄糖作為碳源， 置于 160r/ min ,30 ℃ 搖床培養(yǎng) 24h測其 OD600值。 農(nóng)藥濃度試驗(yàn)：將菌種在含有農(nóng)藥的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24h，制成種子液，按 10%的接種量接于含毒死蜱、 1g/L 的葡萄糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，分別以 60mg/L、 120mg/L、 240mg/L、 480mg/L、 960mg/L 的有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度，置于 160r/ min ,30 ℃ 搖床培養(yǎng) 24h 測其 OD600 值。菌落直徑在 2mm左右。 19 表 菌體生理生化特性 The results of physicological and biochemical tests 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 X01 X02 X03 革蘭氏染色 G G G 淀粉水解試驗(yàn) + + + 過氧化氫酶 + + + 明膠化試驗(yàn) + + + 脂肪水解試驗(yàn) － － － 吲哚試驗(yàn) － － － M． R 試 驗(yàn) － － － V． P 試驗(yàn) － － － 產(chǎn)生硫化氫試驗(yàn) － － － 葡萄糖 Hugh 一 Leifson 試驗(yàn) 氧化產(chǎn)酸 氧化產(chǎn)酸 氧化產(chǎn)酸 檸檬酸鹽試驗(yàn) + + + 碳素化合物的綜合利用 蔗糖 － － － 葡萄糖 + + + 甘露醇 － － － 乳糖 － － － *： “+”表示陽性， “－ ”表示 陰 性 真菌分析結(jié)果 參照文獻(xiàn) [19]對真菌進(jìn)行鑒定。 Z02:菌落白色 ,氣生菌絲呈棉絮狀 ,生長極旺盛 ,常產(chǎn)生黃色色素。 由此鑒定 2株菌株為鐮孢霉屬 ( Fusarium LK. ex Fx)。另外乙醇對于 3 株細(xì)菌生長也有促進(jìn)作用，丙酮也能促進(jìn)菌株 X03 的生長。在 30℃ 、 160 r/min 條件下培養(yǎng) 24h 后于波長 600 下測量吸光度。 由圖 (a)可知，菌株 X01的最適 pH值為 ，菌株 X0 X03最適 pH值為 8． 0，3株細(xì)菌在偏酸或偏堿條件下 (pH值 —)均有一定的生長能力，但 pH值低于 。試驗(yàn)對 5株菌株在1 2 3 42℃ 時的生長情況進(jìn)行了考察。C)OD600Z01Z02 圖 3. 4 最適溫度范圍曲線 Fig3. 4 The curve of optimum temperature range 不同農(nóng)藥濃度對菌株生長的影響 試驗(yàn)選取培養(yǎng)液中毒死蜱的濃度分別為 60mg/L、 120mg/L、 240mg/L、480mg/L、 960mg/L。因此，研究有機(jī)磷農(nóng)藥的降解具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景，篩選能夠 降解有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物顯得尤其重要和關(guān)鍵。 展望 (1)在本實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上， 獲得菌株 的降解酶 ，研究酶學(xué)性質(zhì) 和 有機(jī)磷降解酶的結(jié)構(gòu) 對 作用機(jī)理 的研究 有重大的意義。 總而言之，環(huán)境的治理是一項(xiàng)長期而艱巨的任務(wù)。 Fert Soils, 1990, 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