【正文】 境質量的影響與破壞是嚴重的 [3]。由于 3 取代基團不同，可產生多種多樣的化合物。一般難溶于水 (樂果、敵百蟲除外 )，易溶于有機溶劑 [2]。 目前世界上應用的有機磷農藥商品仍達上百種，特別是在殺蟲劑方面，有機磷類為三大支柱之一，并長年穩(wěn)居首位，從銷售額看，世界有機磷殺蟲劑銷售額1996 年約為 30 億美元，占殺蟲劑 %；目前有機磷殺蟲劑的銷售額逐漸下降至 20 億美元，占 30%左右，仍在殺蟲劑中占首位。 有機磷農藥的研究開發(fā)與推廣應用在經歷了極其輝煌的黃金時代 之后，也面臨了許多不能與人類與環(huán)境相容的安全性問題，從有機磷殺蟲劑的研究開發(fā)策略而言，目前世界上一些農藥公司主要是充分利用、開發(fā)現有的符合毒理學要求的一些有機磷殺蟲劑，而對有機磷殺蟲劑的創(chuàng)新性研究在 1985 年至 20 世紀 90 年代前后便已逐漸進入低潮期或終止。 第一個有機磷化合物（ anophosphorus pound， OP）的研究始于 1820年，直到 1937 年，德國的施拉德第一 次在 Bayer 實驗室發(fā)現具有殺蟲活性的有機磷化合物， 1943 年，施拉德的第一個有機磷殺蟲劑進入德國市場，然后這一領域便有了突飛猛進的發(fā)展。 Biodegradation； screening。在降解菌株中，真菌的生長條件適應范圍比細菌要廣，應用前景更好。采用富集分離法從農藥廠附近收集的土壤中分離篩選出 5株對毒死蜱 具有良好降解作用的菌株，其中包括 3株細菌， 2株真菌。畢業(yè) 論文（設計） 中凡引用他人已經發(fā)表或未發(fā)表的成果、數據、觀點等，均已 明確注明出處。除文中已經注明引用的內容外，不包含任何其他個人或集體已經發(fā)表或在網上發(fā)表的論文。 改變培養(yǎng)基碳源及濃度、毒死蜱濃度、 PH值、溫度等單一條件，測定菌株在波長 600nm的吸光度值，以此來研究菌株的生長狀況，并確定此菌株生長的最適條件。 關鍵詞 :有機磷；降解；篩選；生長條件 II ABSTRACT The study aimed to screen the strain that had good degradation on the chlorpyrifos and investigate the growth condition of degradation bacteria that degrades dichlorvos ,to provided the theoretieal basis for the soil remediation on the anophosphorus pesticide by using microanism． With the help of separation method of enrichment, we can separate five strains which is favorable to the degradation of Chlorpyrifos from the soil collected near the mill of pesticide plant. Among these funguses, there is three bacterium and two funguses. With changes in culture medium, carbon source, concentration, chlorpyrifos’ concentration, pH , temperature and some other single conditions an by the assay of strain’s absorbance value in 600nm’ wavelength, we can research the growing condition of strain and define the best condition for strain’s growth. Identified, three bacteria are Pseudomonas and two funguses are Fusarium LK. ex Fx. Glucose can promote the growth of bacteria. However, when the concentration of pesticide is not so high, Glucose has less influence to the growth of bacteria. The most suitable pH value for bacteria is from 7 to 8 and the optimal temperature is 37 ℃ 。 growth condition 1 第一章 文獻綜述 有機磷農藥概述 發(fā)展簡史 回顧世界農藥的發(fā)展史，有機磷農藥可以說是最重要的一類農用化學品，它們在農業(yè)和商業(yè)上發(fā)揮了巨 大的作用，但始終保持著相對低廉的價格 [1]。至今為止，有機磷農藥超過了 300 種。世界上大型的農藥研究開發(fā)公司終止有機磷殺蟲劑的創(chuàng)新性研究，一方面是由于一些高毒的有機磷殺蟲劑在發(fā)展上受到生態(tài)環(huán)境的制約，但更重要的原因是由于有機磷殺蟲劑開發(fā)的歷史長、品種多，已形 2 成一個比現在已發(fā)現的 AChE 任何一類殺蟲劑在數量上都龐大的多的結構類型，要成功 開發(fā)一個比現有數量眾多的有機磷殺蟲劑活性更高，成本更低的新型殺蟲劑的幾率已很小，如果在效果相同即使成本也相同情況下一個有機磷酸酯類新品種要取代已有穩(wěn)定市場的廉價的有機磷農藥老品種，也需經過一個長期的艱難的時期。即有機磷殺蟲劑占整個殺蟲劑市場的三分之一以上。按其用途可分為殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、生長 調節(jié)劑、誘殺劑、驅蟲劑等 6 大類。 有機磷農藥含有三個磷酯鍵，被稱為磷酸三酯，根據 P 可與 O 或 S 形成雙鍵，按化學鍵又可分為兩種類型，一種是 P 通過雙鍵與 O 結合，形成磷氧雙鍵（ P=O），此類農藥有甲胺磷、氧化 樂果、敵敵畏等 。 所謂農藥環(huán)境污染，是由于人類活動直接或間接地向環(huán)境中排入了超過其自 凈能力的農藥，使環(huán)境的質量降低，以致影響人類及其他環(huán)境生物的安全。(3)農藥工業(yè)廢水的排放和意外泄漏都會造成對環(huán)境的污染。 有機磷農藥毒性很高，有機磷中毒在我國比較多見。 1983 年有機氯農藥被禁止使用后，有機磷農藥由于其半衰期一般在幾周至幾個月，被認為在環(huán)境中降解快、殘留期短而發(fā)展很快。低毒有機磷品種辛硫磷經光解也生成對哺乳動物毒性較大的硫代特普。農藥在治理病蟲害，提高糧食產量方面發(fā)揮著不可低估的作用 ； 每年的化學農藥除了銷售本身所得的效益外，通過 防治病蟲害為人類挽回了數以億萬斤計糧棉的間接效益，對世界農業(yè)生產的持續(xù)、穩(wěn)定、高產起了關鍵的作用。 環(huán)境中有機磷農藥的降解方法 環(huán)境中殘留農藥的消除方法主要有化學降解，光化學降解，超聲波，電離輻射，生物降解等 [3]。其化學特性為強氧化性質，因此具有消毒，除臭，殺菌，等多種功效，特別是臭氧與蔬菜、水果中殘留的有機磷或氨基甲酸脂類農藥發(fā)生氧化還原反應，反應產物為其相應的酸、醇、胺或其氧化物等，這些反應產物大都是水溶性的物質，最后可以用水沖走一些有機磷農藥，因此，農藥殘留通過臭氧降解是安全可行的。 超聲波誘導降解法 超聲誘導降解農藥的原理：通過強氧化性的自由基 (并伴有強烈的沖擊波和時速高達 400Km/h 的射流，在這樣的極端環(huán)境下，泡內氣體和液體交界面的介質被加熱，同時分解產生強氧化性的自由基 [5]。 生物降解 生物降解就是通過生物 (包括各種微生物、植物和動物 )的作用將大分子分解成小分子化合物的過程 [1]。 有機磷農藥的微生物降解 微生物及其降解酶的降解作用是環(huán)境中有機磷農藥分解與轉化的重要途徑，利用微生物及其產生的降解酶進行土壤和水體中化學農藥的去毒與凈化是治理化學農藥污染的有效方法 [8]，并已顯示出良好的應用前景。當有機磷農藥進人土壤環(huán)境，土壤中的微生物產生相應的酶，在這些酶的作用下，上述化學鍵被打斷，使有機磷農藥被降解。有機磷農藥對土壤中的活性酶也存在抑制性，抑制程度的大小隨著外界環(huán)境的變化而變化，而且 不同種類的有機磷農藥對酶的影響也是不同的，但反過來，有機磷農藥對酶的活性也具有一定的刺激作用，朱南文等 (1996) [11]發(fā)現在施用甲胺磷 14d 內，甲胺磷對土壤中酸性磷酸酶、中性磷酸酶和堿性磷酸酶呈一定的抑制作用，而在 4d 以后，對酶的抑制性消失，甚至出現了刺激效應。而當農藥濃度過低時，由于微生物生長的碳、氮源不足，抑制了微生物的生長，從而抑制有機磷農藥的微生物降解，實驗證實樂果濃度在 %時微生物降解的效果最好，而在 %和%則呈下降趨勢。 8 有機磷農藥微生物降解的研究進展 自上世紀 70 年代開始，人們就發(fā)現有些土壤微生物對有機磷農藥具有降解作用。因此，人們的思路從應用微生物菌體凈化農藥污染轉向利用有機磷農藥降解酶。 通過底物類似物親和晶體的 x－衍射的方法，國外的學者們研究了酶的三維構象，發(fā)現酶是同源二聚體，其催化中心具有 2 個 Zn2+離子，它們?yōu)槊傅膸讉€重要的氨基酸殘基（ His55,His57,Lys169,Asp301,His201,His230）所圍繞，形成雙核金屬催化中心，在這里金屬離子結合的羥離子可以親核攻擊底物的親核性磷原子，促進水解反應的發(fā)生，從而使農藥毒性降低。與 OPH 相比， OPDA 降解二甲基底物的速度更快，但對于二乙基底物的水解速度無關。李順鵬等 (2020) [13]分離了多株有機磷降解菌，并對其進行了詳細研究，分離獲得了多種有機磷農藥降解酶的基因，實現了融和表達，并對酶學性質進行了分析。 應用有機磷農藥降解酶就必須解決一個關鍵性的問題 ——如何工業(yè)化、廉價、快速生產有機磷農藥降解酶。 降解有機磷農藥的微生物種類 綜述有關文獻發(fā)現 [18,19]： (1)能夠降解農藥的有 細菌，真菌，放線菌藻類，其中，細菌本身在生理生化具有多種適應能力以及容易誘發(fā)突變，因此，這使得細菌在降解農藥中占主導地位。 (2)真菌：馬鈴薯 200g，葡萄糖 20g，瓊脂 1520g，蒸餾水 l000 ml，自然 pH[21]。2H2O ， FeSO4 試劑如表 主要儀器 及設備 主要儀器及設備如表 試驗方法 菌種的分離及篩選 采用固體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)法，稱取土樣 1 g于 5mL無菌水中振蕩混勻制成菌液。 12 表 試劑 Table The reagents 試劑名稱 生產廠家 牛肉膏、蛋白胨 梁山科泰生物制品有限公司 葡萄糖、蔗糖 廣東汕頭市西隴化工廠 瓊脂條 福建省石獅市瓊脂副食品加工廠 對二甲氨基苯甲醛、 FeSO 對硝基苯酚 天津市博迪化工有限公司 KH2PO4 、 Na2MoO4， CaSO4 (3)莢膜染色 挑取 2． 3 環(huán)菌苔均勻涂于載波片上．用蕃紅染液染色 3min。 2．真菌的鑒定 將滅菌后蓋玻片放在培養(yǎng)皿中的瓊脂表面，在靠近蓋玻片處接種待檢菌，真菌可以直接生長到蓋玻片上，在缺乏營養(yǎng)的蓋玻片上菌絲稀疏，且易產生分生孢子，便于鏡檢 [23,24]。 [20] (2) 過氧化氫酶 取一環(huán)生長旺盛的斜面培養(yǎng)物，涂抹在干凈的玻片上加 1 滴 10%過氧化氫 若有氣泡 (氧氣 )產生，則為接觸酶陽性反應，無氣泡參為陰性反應，斜面培養(yǎng)基 14 不能含有血紅素或紅血球，在此種培養(yǎng)基上生長的產生假陽性。培養(yǎng)至 2， 7， 10， 14 或 30 天時，及時在 20℃ 下觀察微生物的生長和明膠液化的狀況。 (4) 淀粉水解試驗 稱取蛋白胨 5g， NaCl 5g，牛肉膏 3g，可溶性淀粉 2g，瓊脂 15g，加入 1000mL蒸餾水，調節(jié) pH 值到 。如移開菌苔，摘入碘液，菌苔下的培養(yǎng)起也不變色，這表示淀粉水解的反應為陽性。于試劑與培養(yǎng)物姓觸面處呈紅色則為陽性，不呈紅色則為陰性 們反應。 (6) 檸檬酸鹽培養(yǎng)基 每支試管裝 5mL 培養(yǎng)基 (檸檬酸鈉 5g， NaCl 5g， MgSO4 2g， K2HPO4 2g，瓊脂 20g， 1%澳百里酚蘭液 8mL,蒸餾水 1000mL， )滅菌后制成斜面，將試驗菌的斜面培養(yǎng)