【正文】 ..................................................... 20 最適碳源的不同濃度對菌株生長的影響 ........................................... 21 不同 pH 值對菌 株生長的影響 ............................................................ 22 不同溫度對菌株生長的影響 ............................................................... 23 不同農(nóng)藥濃度對菌株生長的影響 ....................................................... 23 第四章 總結(jié)與展望 .............................................................................................. 25 總結(jié) ................................................................................................................ 25 展望 ................................................................................................................ 25 致 謝 ................................................................................................................... 29 I 摘 要 本文的研究目的是 篩選出對毒死蜱 具有良好降解作用的菌株，并對其生長條件進行研究， 為利用微生物進行有機磷農(nóng)藥土壤修復(fù)提供理論依據(jù)。 Fungal growth will augment with the increase of carbon concentration. They can multiply more when the pH value is from 6 to 8. And they will reach their maximum value as the temperature is 30 ℃ . When the pesticide’s concentration is not so high, it has little effect to strain. In the degradation of strain, the extent of fungus’ growth conditions is wider than that of bacteria, and fungus’ application prospect is better. Keyword: Organophosphate 。 1930～ 1985 年有 147 個有機磷化合物被發(fā)現(xiàn)，并由 29 個公司開發(fā)，其中 35%的化合物都由 Bayer 公司開發(fā)，前 50個品種的開發(fā)的時間，每個約需 2～ 3 年，成本也相當(dāng)便宜，后來的每個品種開發(fā)的時間至少為 6 年，開發(fā)費不斷上漲。 有機磷農(nóng)藥的性質(zhì)及分類 有機磷農(nóng)藥除少數(shù)品種為固體 (如樂果、敵百蟲 )外，多數(shù)為油狀液體，工業(yè)品呈淡黃色至棕色，具有大蒜樣特殊臭味。 有機磷農(nóng)藥的危害 農(nóng)藥環(huán)境污染造成的損失是多方面的。土壤中的農(nóng)藥殘留導(dǎo)致土壤中的生物多樣性相對降低，多種種類的生物減少，土質(zhì)降低，生產(chǎn)能力下降。有機磷農(nóng)藥的毒性除受農(nóng)藥自身性質(zhì)影響外，制劑中的某些毒性物質(zhì)，代謝過程中的中間體及降解產(chǎn)物也會使農(nóng)藥的毒 性大增。而在污染治理的實踐中，高效，無二次污染，以及低成本的生物降解越來越體現(xiàn)出了應(yīng)用的優(yōu)勢。 過氧化氫法：以過氧化氫為氧化劑來降解農(nóng)藥，其降解產(chǎn)物和通過臭氧方法得到的反應(yīng)產(chǎn)物一樣。 6 光學(xué)降解 農(nóng)藥經(jīng)過太陽光或者紫外線的照射后，那些比較脆弱的化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，因此，形成了特別活潑的中間產(chǎn)物 (自由基 )，隨后，自由基和溶劑或者其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，便得到了光解產(chǎn)物。 YonezawwaY(1979)[8]等認(rèn)為當(dāng)微生物對有機化合物的降解作用是由其細胞內(nèi)的酶引起時，微生物降解的整個過程可以分為三個步驟 ： 首先是化合物在微生 7 物細胞膜表面的吸附，這是一個動態(tài)平衡 ； 其次是吸附在細胞膜表面的化合物進入細胞膜內(nèi)，在生物量一定時，化合物對細胞膜的穿透率決定了化合物穿透細胞膜的量 ； 最后是化合物進入微生物細胞膜內(nèi)與降解酶結(jié)合發(fā)生酶促反應(yīng)，這是一個快速的過程。這可能是因為當(dāng)有機磷農(nóng)藥開始加人土壤后，農(nóng)藥的濃度高對土壤中微生物生長和活動產(chǎn)生抑制作用，從而 對微生物體內(nèi)酶和土壤中的游離酶產(chǎn)生抑制作用，但有機磷農(nóng)藥能促進土壤中一些微生物 (如細菌、真菌和放線菌等 )的生長并抑制一些微生物 (如固氮菌 )的生長，所以隨著細菌、真菌和放線菌數(shù)量的增多以及農(nóng)藥濃度的減少，酶的活性也就提高了。進一步研究發(fā)現(xiàn)這些微生物之所以能降解有機磷農(nóng)藥是因為它們能分泌一 種能水解磷酸酯鍵的酶，即后來研究的有機磷農(nóng)藥降解酶。 Munnecke 等分離到的有機磷農(nóng)藥降解酶對試驗用的甲基對硫磷、對硫磷、二嗪農(nóng)、毒死蜱等 7 種有機磷農(nóng)藥均能有效降解，在 22℃ 時降解效率比化學(xué)降解快 10002450 倍，且該酶不為農(nóng)藥及農(nóng)藥制劑中溶劑所抑制，對環(huán)境條件有較寬的忍受范圍。陳亞麗 (2020)[14]等從一株假單胞桿菌 WBC3 中分離到降解甲基對硫磷的有機磷農(nóng)藥降解酶，已進行 X－衍射分析其三維結(jié)構(gòu)。表 [20]為部分菌種和其能夠降解的農(nóng)藥。 選擇培養(yǎng)基 (瓊脂平板 )：在富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入 100mg/L的毒死蜱。7H2O、 (NH4)2SO4 、 K2HPO4 西安化學(xué)試劑廠 NaCl、 NaOH、 HCl、 95%乙醇 西安化學(xué)試劑廠 無水乙醇、甲醇、丙酮 西安化學(xué)試劑廠 毒死蜱 美國陶氏益農(nóng)公司 30%H2O2 天津市化 學(xué)試劑六廠 溴百里香酚藍 上海慨洋生物技術(shù)有限公司 尿素、檸檬酸鈉 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司 明膠 青島化學(xué)試劑廠 甲基紅 天津市東方衛(wèi)生材料廠 乙醚、硫代硫酸鈉 西安化學(xué)試劑廠 半乳糖 上海試劑二廠 表 儀器及設(shè)備 Table Instruments and equipment 儀器名稱 及型號 生產(chǎn)廠家 SWCJ1G型單人凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司 LRH250Ⅱ 生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠 LDZX75KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠 HZQF全溫振蕩培養(yǎng) 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司 實驗室 pH計 梅特勒 托利多儀器（上海）有限公司 722光柵分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司 XSZ2GA光學(xué)顯微鏡 重慶光電儀器有限公司 13 菌種的鑒定 2． 2． 2． 1 形態(tài)特征 （ 1） 菌落特征 將菌接種于牛肉膏平板培養(yǎng)基上， 32℃ 恒溫培養(yǎng) 48h，觀察菌體和菌落 [21]。 生理生化特征測定 (1)革蘭氏染色 先用初染劑結(jié)晶紫進行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇脫色，最后用復(fù)染劑番紅復(fù)染。如果有菌生長，菌苔下的明膠表面也有凹陷，小窩(須與未接種的對照管比較，因明膠培養(yǎng)過久，水分的蒸發(fā)也會產(chǎn)生凹陷 )為輕度水解，按陽性記錄。 (5) 吲哚試驗 培養(yǎng)基 :每支試管裝 5mL 液體培養(yǎng)基 (蛋白胨 10g，牛肉膏 5g， NaCL 5g，)，滅菌，將被測菌接種于上述培養(yǎng)基中，留一無接種管對照。如果得到可疑的結(jié)果應(yīng)重復(fù)測定，并在室溫培養(yǎng) 7 天。 (8) 產(chǎn)生 H2S 試驗 每支試管裝 5mL 液體培養(yǎng)基（牛肉膏 3g，酵母浸膏 3g，蛋白胨 10g， FeSO4 ， NaCl 5g，硫代硫酸鈉 ，蒸餾水 1000mL， ）。若是只有無凡士林的管內(nèi)產(chǎn)酸而有凡土林覆蓋的管內(nèi)卻無變 化或表面微見生長，即為氧化產(chǎn)酸。 pH試驗 :將菌種在含有農(nóng)藥的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24h，制成種子液，按 10%的接種量接于含 300mg/L的毒死蜱、 1g/L的葡萄糖的無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，該培養(yǎng)基以 NaOH和 H2SO4調(diào)節(jié) pH，令其 pH值分別是 、 、 、 、 。 X02: 革蘭氏陽性菌，棒狀、排列不規(guī)則；菌落桔黃色、較大、形狀不規(guī)則、個別為橢圓形、比較光滑、有光澤、生長尚好、凸起、菌落直徑在 3mm 左右。 分生孢子梗細長分枝。 由圖 3. 1(b)可知，降解菌中的真菌最適碳源為葡萄糖，其他的幾種碳源也是真菌生長可選擇的較優(yōu)碳源，可見 2 株真菌降解菌對碳源的適用范圍較廣。 由圖 (b)可知，菌株 Z01的最適 pH值為 ，菌株 Z02的最適 pH值為 。在 30℃ 、 160 r/min 條件下培養(yǎng) 24h 后于波長 600 下測量吸 24 光度。 (2)分離純化菌株產(chǎn)生的降解酶，進行降解酶固定化的研究，從而實現(xiàn)有機磷農(nóng)藥廢水的生物治理，這也是以后值得研究和開發(fā) 。 姜廣正 . 鐮孢霉屬 (Fusarium)真菌鑒定方法 [J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版 )， 1984,01:5968. 29 致 謝 本研究課題從選題到論文的審閱定稿，都是在惠有為老師的悉心指導(dǎo)和親切關(guān)懷下完成的。四種農(nóng)藥對土壤脫氫酶在影響 [J].環(huán)境化學(xué)， 2020, 19(6):523527 [13] 王永杰，李順鵬，沈標(biāo)等．有機磷農(nóng)藥光譜活性降解菌的分離及其生理特性的研究 [J]．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 1999， 22(2)： 42—45. [14] 陳亞麗 張先恩 劉虹 .甲基對硫磷降解菌假單胞菌 WBC3 的篩選及其降解性能的研究 [J]. 微生物學(xué)報 ,2020 ,42(4):490497. 28 [15] Omar SA. Availability of phosphorus and sulfur of insecticide origin by fungi[J]. B iodegradation, 1998, 9 (5) : 327～ 336. [16] Sikora LJ, Kaufman D, HornogLC. Enzyme activity in soils showing degra dation of anophosphosphate insecticides[J]. B iol amp。 (3) 在 5株降解菌株中，真菌的生長條件適應(yīng)范圍比細菌要廣，因此真菌降解有機磷農(nóng)藥的應(yīng)用前景更好。C)OD600XO1X02X03 (b)0115 22 30 37 45溫度(176。在 30℃ 、160 r/min條件下培養(yǎng) 24h后于波長 600下測量吸光度。 由圖 3. 1(a)可知，降解菌中的細菌最適碳源為葡萄糖。分生孢子無色 ， 分為大小兩種類型 ： 小型孢 子數(shù)量較少 ,多為單細胞 ， 也有雙細胞卵圓形或長圓形 ， 單生 ； 大型孢子數(shù)量多 ,為 4個細胞 ， 微彎 ,鐮刀形 ， 無足細胞和厚垣孢子。 細菌分析結(jié)果 1. 形態(tài)觀察 X01: 革蘭氏陽性菌，短棒狀、排列成串；菌落乳白色、不規(guī)則凸起、表面較干燥、生長良好。 生長特性研究 最適碳源試驗：將菌種在含有農(nóng)藥的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24h，制成種子液，按10%的接種量接于含 300mg/L的毒死蜱的無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，分別以甲醇、乙醇、丙酮、葡萄糖、蔗 糖、對硝基苯酚為碳源， 置于 160r/ min ,30 ℃ 搖床培養(yǎng)24h測其 OD600值。 (9) 葡萄糖 Hugh——Leifson 試驗 每支試管裝 5mL 培養(yǎng)基 (蛋白胨 ， NaCl ， K2HPO4 ，葡萄糖 ， 16 瓊脂 ， 1%澳百里酚蘭液 ，蒸餾水 100mL， )，滅菌后直立凝固，穿刺接種細菌，同時接兩支，一管不加凡士林，另一管加 厘米厚的熔化的無菌凡士林。檢驗時按培養(yǎng)液的十分之一加入 O’Meara 試劑，充分搖勻。 (6) 檸檬酸鹽培養(yǎng)基