氨基酸組成分析ppt課件-文庫(kù)吧資料
2025-05-07 04:16本頁(yè)面
【正文】 10℃ 真空水解 24h，水解結(jié)束后用 200181。另外，在膜上做氨基酸 組成分析時(shí)可以做一個(gè)空白對(duì)照，具體操作時(shí)將含蛋白條帶的 PVDF膜 割下，另取一條相同面積的轉(zhuǎn)移膜作為空白，分別置于水解指管中 ,加入 70181。 第四節(jié) 氨基酸組成原位分析 如果蛋白質(zhì)樣品采用電泳法 (如 SDSPAGE)分離，則很難從凝膠中洗 脫下來(lái)，可采用電印跡法把樣品轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上，然后在 PVDF膜上直 接進(jìn)行鹽酸水解和氨基酸分析，稱之為原位 (in situ)分析。 (2)氧化法 氧化反應(yīng)被用來(lái)轉(zhuǎn)化半胱氨酸和胱氨酸成為半胱磺酸，過(guò) 甲酸氧化反應(yīng)的缺點(diǎn)是它會(huì)影響其他氨基酸特別是甲硫氨酸 會(huì)轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸砜，酪氨酸會(huì)降解。烷化試劑包括 4— 乙烯 吡啶和碘代乙酸。 雖然蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸分析法對(duì)大多數(shù)氨基酸是快速、準(zhǔn)確和靈 敏的，但在半胱氨酸定量時(shí)仍遇到很大困難，解決這個(gè)問(wèn)題的途徑有兩 種，一種是還原烷化法，另一種是氧化法。酪 氨酸常被用來(lái)確定蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的含量，計(jì)算公式復(fù)雜。 4．酶 蛋白酶水解法有時(shí)也有應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)是條件溫和，對(duì)天冬酰胺和谷氨 酰胺及色氨酸均無(wú)破壞作用，但酶水解法往往不完全，必須用酸水解法 校正。 3mol/L 巰基乙磺酸 (mercaptoethanesulfonic acid) 或 4mol/L甲磺酸 (methanesulfonie acid)在水解時(shí)對(duì) 色 氨酸 有一定的保護(hù)作用。 這些添加劑包括琉基乙酸和 β琉基乙醇，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn) 認(rèn)為液相水解時(shí)加入巰基乙醇對(duì) 色氨酸 保護(hù)效果較好，色氨 酸的回收可達(dá) 80％。生物應(yīng) 用公司（ ABI）曾設(shè)計(jì)過(guò)一種 “ 測(cè)試肽 ” ，即人工合成 18種不 同氨基酸的肽 (除 Gln、 Asn外 )，這樣每種氨基酸出現(xiàn)的頻 率都是 1，用此肽來(lái)校正回收，看來(lái)機(jī)會(huì)均等，是一種可以 采納的方法，但在實(shí)際樣品中，不太可能出現(xiàn)這種理想情 況。在實(shí)驗(yàn)中 通常采用一些標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，如細(xì)胞色素 c(Cyt c)、核糖核酸 酶 (RNase)或胰島素 (insulin)為標(biāo)樣進(jìn)行水解、衍生和色 譜分析來(lái)計(jì)算回收，從而考驗(yàn)蛋白質(zhì)分析的可靠程度和評(píng)價(jià) 方法的適用性。
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