氨基酸組成分析ppt課件-文庫吧資料
2025-05-07 04:16本頁面
【正文】 10℃ 真空水解 24h，水解結(jié)束后用 200181。另外，在膜上做氨基酸 組成分析時可以做一個空白對照，具體操作時將含蛋白條帶的 PVDF膜 割下，另取一條相同面積的轉(zhuǎn)移膜作為空白，分別置于水解指管中 ,加入 70181。 第四節(jié) 氨基酸組成原位分析 如果蛋白質(zhì)樣品采用電泳法 (如 SDSPAGE)分離，則很難從凝膠中洗 脫下來，可采用電印跡法把樣品轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上，然后在 PVDF膜上直 接進(jìn)行鹽酸水解和氨基酸分析，稱之為原位 (in situ)分析。 (2)氧化法 氧化反應(yīng)被用來轉(zhuǎn)化半胱氨酸和胱氨酸成為半胱磺酸，過 甲酸氧化反應(yīng)的缺點是它會影響其他氨基酸特別是甲硫氨酸 會轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸砜，酪氨酸會降解。烷化試劑包括 4— 乙烯 吡啶和碘代乙酸。 雖然蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸分析法對大多數(shù)氨基酸是快速、準(zhǔn)確和靈 敏的，但在半胱氨酸定量時仍遇到很大困難，解決這個問題的途徑有兩 種，一種是還原烷化法，另一種是氧化法。酪 氨酸常被用來確定蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的含量，計算公式復(fù)雜。 4．酶 蛋白酶水解法有時也有應(yīng)用，其優(yōu)點是條件溫和，對天冬酰胺和谷氨 酰胺及色氨酸均無破壞作用，但酶水解法往往不完全，必須用酸水解法 校正。 3mol/L 巰基乙磺酸 (mercaptoethanesulfonic acid) 或 4mol/L甲磺酸 (methanesulfonie acid)在水解時對 色 氨酸 有一定的保護(hù)作用。 這些添加劑包括琉基乙酸和 β琉基乙醇，我們通過實驗 認(rèn)為液相水解時加入巰基乙醇對 色氨酸 保護(hù)效果較好，色氨 酸的回收可達(dá) 80％。生物應(yīng) 用公司（ ABI）曾設(shè)計過一種 “ 測試肽 ” ，即人工合成 18種不 同氨基酸的肽 (除 Gln、 Asn外 )，這樣每種氨基酸出現(xiàn)的頻 率都是 1，用此肽來校正回收，看來機(jī)會均等，是一種可以 采納的方法，但在實際樣品中，不太可能出現(xiàn)這種理想情 況。在實驗中 通常采用一些標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，如細(xì)胞色素 c(Cyt c)、核糖核酸 酶 (RNase)或胰島素 (insulin)為標(biāo)樣進(jìn)行水解、衍生和色 譜分析來計算回收，從而考驗蛋白質(zhì)分析的可靠程度和評價 方法的適用性。
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