植物細(xì)胞培養(yǎng)ppt課件-文庫(kù)吧資料
2025-05-07 02:17本頁(yè)面
【正文】 培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。 植物細(xì)胞培養(yǎng)需要解決的問(wèn)題 （ 1）氧和二氧化碳的控制，過(guò)多氧過(guò)少氧均不利于生長(zhǎng)； （ 2）營(yíng)養(yǎng)物的供應(yīng)； （ 3）細(xì)胞密度過(guò)高引起細(xì)胞團(tuán)聚甚至分化 （ 4）培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞的分化的防止， （ 5）細(xì)胞取得中微生物的去除； （ 6）細(xì)胞壁脆性的存在要求培養(yǎng)體系剪切力要小； 二 .培養(yǎng)系統(tǒng) 懸浮培養(yǎng)系統(tǒng) 機(jī)械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng) 機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器通常是根據(jù)植物細(xì)胞的特性在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上作如下改進(jìn)： 攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式 因?yàn)橹参锛?xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，需要隨時(shí)補(bǔ)充水分和營(yíng)養(yǎng)，因此必須設(shè)計(jì)加液裝置； 由于植物細(xì)胞的生理活動(dòng)需要新鮮空氣，且細(xì)胞代謝也可能產(chǎn)生有害氣體，所以必須設(shè)計(jì)通氣裝置； 為便于取樣觀察，一般還設(shè)計(jì)有取樣口 。 167。 看護(hù)培養(yǎng) 概念：用一塊愈傷組織或植物離體組織看護(hù)單細(xì)胞使其生長(zhǎng)增殖的一種單細(xì)胞培養(yǎng)方法 微室培養(yǎng) 概念：人工制造一個(gè)小室，將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法，稱微室培養(yǎng)。 植板率 (％ )＝ (形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù) /接種的細(xì)胞數(shù) ) 100％ 計(jì)算式中每個(gè)平板新形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)的計(jì)數(shù)方法有兩種：一是直接計(jì)數(shù)法，注意計(jì)量時(shí)要掌握合適的時(shí)間，即細(xì)胞團(tuán)肉眼已能分辨，但尚未長(zhǎng)合到一起的時(shí)候。 待植板后的培養(yǎng)基完全凝固后，用石蠟或parafilm封口膜將培養(yǎng)皿封嚴(yán)以防污染 在 25℃ 黑暗條件下培養(yǎng) 3周即可長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的愈傷組織。 排除體細(xì)胞的干擾 利于對(duì)細(xì)胞活動(dòng)跟蹤觀察 二、單細(xì)胞培養(yǎng)的方法 細(xì)胞平板培養(yǎng) 概念：將制備好的單細(xì)胞懸浮液，按照一定的細(xì)胞密度，接種在 1mm左右的薄層固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，稱之為平板培養(yǎng) 主要技術(shù)要點(diǎn)： 單細(xì)胞的分離：一般采用酶分離法，小細(xì)胞團(tuán)不能超過(guò) 6個(gè)細(xì)胞，因此過(guò)濾時(shí)網(wǎng)篩的網(wǎng)眼要選擇合適。 一、植物單細(xì)胞培養(yǎng)的意義 建立單細(xì)胞無(wú)性系 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞間細(xì)胞間在遺傳、生理和生化上存在差異，這些差異反映在它們的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病蟲(chóng)性和抗逆性等方面。用于處理 的細(xì)胞系最好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 無(wú)論何種細(xì)胞同步化處理，對(duì)細(xì)胞本身或多或少都有一定的傷害。 常用的抑制劑有 5氟脫氧尿苷， 5氨基尿嘧啶、羥基尿等。 化學(xué)方法 1）饑餓法 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，若斷絕供應(yīng)一種細(xì)胞分裂所必需的營(yíng)養(yǎng)成分或激素，使細(xì)胞停滯在 G1或 G2期，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的饑餓之后，當(dāng)在培養(yǎng)基中重新加入這種限制因子時(shí)，靜止細(xì)胞就會(huì)同步進(jìn)入分裂。 Fujimura分離胡蘿卜懸浮液 懸浮液 47μm膜過(guò)濾 濾液 31 μm膜過(guò)濾 收集 加入到 10%~18%的 Ficoll 加入等體積的培養(yǎng)基 網(wǎng)上細(xì)胞 180g離心 5min 收集各細(xì)胞層的細(xì)胞 用培養(yǎng)基洗滌 分別接種 2）冷處理法。 培養(yǎng)條件：方式、溫度、繼代周期 四、懸浮細(xì)胞的同步化 細(xì)胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎。 細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般 2～ 3天甚至更短時(shí)間便可增加一倍。 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。 一般用孚爾根染色法，先將組織用1molHCl在 60℃ 水解后染色，常規(guī)鏡檢，統(tǒng)計(jì) 500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算。細(xì)胞的干重和鮮重一般以每毫升懸浮培養(yǎng)物的重量表示。 將一定量的細(xì)胞懸浮液加到預(yù)先稱重的尼龍布上，用水沖洗并抽濾除去細(xì)胞粘著的多余水滴，然后稱重，兩者差就是細(xì)胞的鮮重。以每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞體積的毫升數(shù)來(lái)表示。 A、細(xì)胞記數(shù) 注意：由于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞并不會(huì)呈游離單細(xì)胞，因此 通過(guò)培養(yǎng)瓶中直接取樣很難進(jìn)行可靠的細(xì)胞記數(shù)。 依此，多次，可建立良好的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。 D、如果使處在靜止期的細(xì)胞懸浮液保持時(shí)間太長(zhǎng)，則會(huì)引起細(xì)胞的大量死亡和解體 操作注意事項(xiàng)： 對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞繼代時(shí)，進(jìn)液口的孔徑要小，只能通過(guò)單
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