細胞培養(yǎng)技術-文庫吧資料
2024-08-28 20:38本頁面
【正文】 加入 %臺盼蘭染液，染色 2一 3分鐘。 ? 2. 用 75%酒精噴細胞冷凍細管用滅菌過的紗布擦試細管 用滅菌過剪刀剪掉細管 2頭 將細胞懸液移至離心管中，補加培養(yǎng)液， 1500rpm低速離心 6min，去上清（ DMSO 在常溫下對細胞有毒，應在細胞復蘇后盡量除去） 棄掉上清液、加培養(yǎng)液進行培養(yǎng) 第二天待細胞貼壁時進行換液把死的細胞去除 后每隔 23天換液 待細胞生長至一定密度后即可傳代。 ? 4. 凍存 4℃ 半個小時 20℃ 2小時 80℃ 過夜液氮長期保存。 ?冷凍方法 ? 1. 選用對數(shù)生長期細胞，在收集細胞 24h前換液一次。貯存在－ 130℃ 以下低溫中能減少冰晶的形成。 ?細胞冷凍原理 在不加保護條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會形成結(jié)晶，能導致細胞內(nèi)發(fā)生一系列變化，如電解質(zhì)濃度升高、滲透壓改變、脫水、等，能引起細胞死亡。但當細胞離開活體開始原代培養(yǎng)后，它的各種生物學特性都將逐漸發(fā)生變化，并隨著傳代次數(shù)的增加和體外培養(yǎng)條件的變化而不斷有新的變化。 ?細胞冷凍 細胞凍存和復蘇是細胞培養(yǎng)不可缺少的步驟。有限細胞系在體外一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。 圖 21 組織塊培養(yǎng) 5天的水牛 圖 22 酶消化法培養(yǎng) 5天的水牛 胎兒成纖維細胞 胎兒成纖維細胞 ? 傳代培養(yǎng) ? 當細胞鋪滿細胞培養(yǎng)瓶底部時就要及時對細胞進行傳代，否則細胞生長會受到影響。 ? 胰蛋白酶消化法 ? 屠宰場胎牛 回到實驗室用 75%酒精噴整個牛體，剪一小塊腿部肌肉 PBS洗兩次 移入操凈臺 把小塊肌肉剪為綠豆顆粒大小 75%酒精浸泡 1分鐘 PBS洗 3次把組織塊放入 20ml的小瓶用剪刀把組織剪碎 加入34ml的胰蛋白酶放入培養(yǎng)箱消化組織 每隔 10分鐘用吸管把組織給反復吹散利于細胞解離出 當看到液體混濁基本沒有塊狀時，吸少許 放入顯微鏡下觀察，當發(fā)現(xiàn)細胞大部分解離時加 12ml含血清的 DMEN培養(yǎng)液終止消化 移入離心管 15002022轉(zhuǎn) /分鐘離心 6分鐘 棄掉上清液 加入培養(yǎng)液重懸細胞把細胞輕輕吹散后放入細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。（以水牛成纖維細胞 BEF為例 ? 組織塊法 ： 屠宰場胎牛 回到實驗室用 75%酒精噴整個牛體，剪一小塊腿部肌肉 PBS洗兩次 移入操凈臺 把小塊肌肉剪為綠豆顆粒大小 75%酒精浸泡 1分鐘 PBS洗 3次把小組織塊均勻排在培養(yǎng)瓶底部（ 組織塊與組織塊之間要留有空隙 ） 加少許培養(yǎng)液（培養(yǎng)液以稍微浸過組織塊為宜） 培養(yǎng)第二天補加少許培養(yǎng)液 再過兩天換液加入新的培養(yǎng)液（此時組織塊已貼培養(yǎng)瓶底部，培養(yǎng)液以浸過組織塊，鋪滿培養(yǎng)瓶底部為宜） 后每隔23天換液一次，直到細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部 細胞長滿時可用注射器針把組織塊給挑出，然后傳代細胞。 （無論是傳代培養(yǎng)還是原代，對細胞進行操作切記： 細心，專心，動作要輕 ） ?原代培養(yǎng)：從組織上取得的細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為原代培養(yǎng)。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他有害物質(zhì)。 滲透壓： 培養(yǎng)液滲透壓一般介于 260~320 mosm/kg之間 培養(yǎng)液 :目前常用的基礎培養(yǎng)液均已商品化，如 RPMI1640， MEM， DMEM， F12等，可根據(jù)培養(yǎng)需求合理選擇 貼壁和鋪展因子， 如某些細胞培養(yǎng)初不易貼壁 ,可以預先用
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