細胞培養(yǎng)相關技術ppt課件-文庫吧資料
2025-05-09 03:43本頁面
【正文】 或以其為載體構建的重組DNA導入細菌體內，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。 培養(yǎng)細胞活力測定 ? 臺盼藍法， trypan blue， 利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。當 chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為 1 mm2 x mm= x 104 ml。 ? 去上清 ， 加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞 。 ? 5分鐘內用培養(yǎng)液稀釋至原體積的 10倍以上 。 ? 常用的低溫保護劑是 DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高細胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在細胞外形成冰晶，減少細胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。 慢凍程序 ? 標準程序： 當溫度在 25 ℃ 以上時， 1～ 2 ℃ /min 當溫度達 25 ℃ 以下時， 5～ 10 ℃ /min 當溫度達 100℃ 時，可迅速放入液氮中 細胞凍存器 ? 簡易程序： 將冷凍管 （ 管口要朝上 ） 放入紗布袋內 ， 紗布袋系以 線繩 ，通過線繩將 紗布袋固定于液氮罐罐口 ， 按每分鐘溫度下降 1～ 2 ℃ 的速度 ， 在 40分鐘內降至液氮表面 ， 停 30分鐘后 ， 直接投人液氮中 。 ? 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反．結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。常用的消化液有 ％的胰蛋白酶液。 ? 半懸浮生長細胞傳代 此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。 細胞傳代方法 根據細胞生長的特點，傳代方法有 3種。整個操作過程盡量在無菌臺靠里面一點。 ? 清洗雙手及手腕，戴乳膠手套，然后用 75%酒精擦拭。培養(yǎng)基內青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升 100單位。 ? 血清的滅活（消除補體活性）： 56 ℃ ， 30 分鐘 ? 血清的消毒：過濾除菌 抗生素的使用 ? 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。 ? 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質量最好。 ? 人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 ? 合成培養(yǎng)基： 根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成的。 ? 胰蛋白酶液消化時間： 210分鐘 。 ? 胰蛋白酶是一種黃白色 粉末 ， 用無 Ca2+、 Mg2+的 PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是 ％ 。 實驗物品準備 常用玻璃器皿清洗 ? 浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（ 24小時）、 ? 流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、 50℃ 烘干 清潔液的配制 細胞培養(yǎng)用液的配制 水：新鮮配置的三蒸水或去離子水 平衡鹽溶液： 無 Ca2+、 Mg2+的緩沖液 PBS： NaCl g KCl g g KH2PO4 加水至 1000 ml 消化液 ? 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健 ， 除去細胞間粘蛋白及糖蛋白 ， 影響細胞骨架 ， 從而使細胞分離 。定期消毒（ 90 ℃ ， 14 h或者紫外殺菌 )。 ? 使用 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題： ①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時
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