細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)ppt課件(存儲(chǔ)版)
【正文】 ? 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。整個(gè)操作過程盡量在無菌臺(tái)靠里面一點(diǎn)。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。 ? 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的 10倍以上 。 轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化的區(qū)別 ? 轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒 DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。 ? DNA質(zhì)量 ? 一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，如果 DNA不純，如帶少量的鹽離子、蛋白、代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行?？膳c F肌動(dòng)蛋白結(jié)合，使 F肌動(dòng)蛋白保持穩(wěn)定。適于胞質(zhì)抗原或者質(zhì)膜上靠近胞質(zhì)一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。 Triton X100是最常用的通透劑，但是它將破壞細(xì)胞膜，因此不適用于細(xì)胞膜相關(guān)抗原。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。 培養(yǎng)細(xì)胞活力測定 ? 臺(tái)盼藍(lán)法， trypan blue， 利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會(huì)呈色。 ? 常用的低溫保護(hù)劑是 DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在細(xì)胞外形成冰晶，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。常用的消化液有 ％的胰蛋白酶液。 ? 清洗雙手及手腕，戴乳膠手套，然后用 75%酒精擦拭。 ? 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 實(shí)驗(yàn)物品準(zhǔn)備 常用玻璃器皿清洗 ? 浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（ 24小時(shí)）、 ? 流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、 50℃ 烘干 清潔液的配制 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制 水：新鮮配置的三蒸水或去離子水 平衡鹽溶液： 無 Ca2+、 Mg2+的緩沖液 PBS： NaCl g KCl g g KH2PO4 加水至 1000 ml 消化液 ? 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健 ， 除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白 ， 影響細(xì)胞骨架 ， 從而使細(xì)胞分離 。 停止期（平臺(tái)期） ： ? 細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂 ? 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性 細(xì)胞培養(yǎng)方式 ? 群體培養(yǎng)（ mass culture），將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層 ? 克隆培養(yǎng)（ clonal culture），將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個(gè)細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生長增殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆（ clone）。 ? 美國標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫或細(xì)胞銀行（ ATCC）和人遺傳突變細(xì)胞庫（ HGMR）、細(xì)胞衰老細(xì)胞庫（ CAR）等 ? ATCC不僅是美國，也是世界最大的細(xì)胞庫，是世界衛(wèi)生組織 WHO的國際培養(yǎng)細(xì)胞文獻(xiàn)中心 ? ATCC現(xiàn)液氮凍存有 3200個(gè)已經(jīng)過鑒定的細(xì)胞系，接納來自世界各國已經(jīng)鑒定的細(xì)胞予以貯存，同時(shí)也向世界各國的研究者或?qū)嶒?yàn)室免費(fèi)提供研究用細(xì)胞（做盈利性研究時(shí)收費(fèi)） ? 武漢大學(xué)細(xì)胞典藏物中心 細(xì)胞典藏物中心 每代貼附生長細(xì)胞的生長過程 ? 游離期 ? 貼壁期 ? 潛伏期 ? 對(duì)數(shù)生長期 ? 停止期（平臺(tái)期） 游離期： ? 細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。 細(xì)胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞生存、生長并維持
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