細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-30 03:43 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 成 ? 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80％一 95％ ? 血清 5％一 20％ ? 碳酸氫鈉 g/L ? 青、鏈霉素 各 100單位／毫升 細(xì)胞培養(yǎng)基本方法（無(wú)菌原則） ? 無(wú)菌工作臺(tái)用 75%酒精擦拭干凈，紫外線照射 40分鐘以上。 ? 清洗雙手及手腕，戴乳膠手套，然后用 75%酒精擦拭。 ? 操作時(shí)注意無(wú)菌臺(tái)內(nèi)空間層次。整個(gè)操作過(guò)程盡量在無(wú)菌臺(tái)靠里面一點(diǎn)。手及物品不要在暴露的瓶口上方來(lái)往，嚴(yán)格注意無(wú)菌操作。 細(xì)胞傳代方法 根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳代方法有 3種。 ? 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（ 1000轉(zhuǎn) /分 ）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 ? 半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。 ? 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有 ％的胰蛋白酶液。 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法 ? 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液 ? 適量 PBS洗凈殘留培養(yǎng)液 ? 加入 12 ml ％的胰蛋白酶液 (以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)） ? 靜置 210 min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)） ? 加入培養(yǎng)液，終止胰酶消化作用 ? 用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液 ? 吸取 1/3細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi) ? 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi) ? 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 ? 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。 凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 ? 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 ? 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。 ? 復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。 慢凍程序 ? 標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在 25 ℃ 以上時(shí)， 1～ 2 ℃ /min 當(dāng)溫度達(dá) 25 ℃ 以下時(shí)， 5～ 10 ℃ /min 當(dāng)溫度達(dá) 100℃ 時(shí)，可迅速放入液氮中 細(xì)胞凍存器 ? 簡(jiǎn)易程序： 將冷凍管 （ 管口要朝上 ） 放入紗布袋內(nèi) ， 紗布袋系以 線繩 ，通過(guò)線繩將 紗布袋固定于液氮罐罐口 ， 按每分鐘溫度下降 1～ 2 ℃ 的速度 ， 在 40分鐘內(nèi)降至液氮表面 ， 停 30分鐘后 ， 直接投人液氮中 。 低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 ? 在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。 ? 常用的低溫保護(hù)劑是 DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在細(xì)胞外形成冰晶，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。 細(xì)胞凍存方法 ? 預(yù)先配制凍存液： 含 20%血清培養(yǎng)基 ? 10% DMSO ? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉海梦艽荡蛑瞥杉?xì)胞懸液（ 1 106 ～ 5 106細(xì)胞 /ml) ? 加入 1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期 細(xì)胞復(fù)蘇方法 ? 從液氮中取出冷凍管 ， 迅速投入 37～ 38 ℃ 水浴中 ， 使其融化 （ 1分鐘左右 ） 。 ? 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的 10倍以上 。 ? 低速離心 10分鐘 。 ? 去上清 ， 加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞 。
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