【正文】 （ 2）操作者 動(dòng)作要輕 ，必須在操作臺(tái)內(nèi)點(diǎn)上酒精燈換液或操作時(shí)要注意對(duì)培養(yǎng)液瓶，細(xì)胞瓶的瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)火焰上燒，搶頭，吸管不要碰到不潔物。支原體污染開始不容易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對(duì)青霉素有抗性，多吸附于細(xì)胞表面或散在細(xì)胞之間。 四乙基異硫氰酸羅達(dá)明（ＴＭＲＩＴＣ）標(biāo)記最大吸收光譜為５５０ nm，最大發(fā)射光譜為６２０ nm，橙紅色熒光，與ＦＩＴＣ的黃綠色光對(duì)比清晰，與蛋白質(zhì)結(jié)合方式同ＦＩＴＣ，可以用來雙標(biāo)記研究。 ? 2. 用常規(guī)胰蛋白酶消化將細(xì)胞消化下來，按 106107/ml細(xì)胞濃度，懸浮于含 10％ DMSO的培養(yǎng)液中（此時(shí)培養(yǎng)液要冷的，因 DMSO仔常溫下可以產(chǎn)生毒性） ? 3. 用吸管吸取細(xì)胞懸液，分裝于 存管中用火燒封口。一般 78天細(xì)胞可以長滿。 細(xì)胞凋亡特征 凋亡發(fā)生的過程表現(xiàn)（細(xì)胞縮小 → 致密染色質(zhì)邊集 → 核碎片 → 凋亡小體） 喪失了特殊的表面結(jié)構(gòu)（微絨毛等）和接觸 區(qū)，形成光滑的輪廓，從周圍活細(xì)胞中分離出來 細(xì)胞縮?。孩侔麧{細(xì)胞器集中 ②胞膜出芽或起泡 ③細(xì)胞皺縮； ? 保持胞漿細(xì)胞器完整性 掃描電鏡下，細(xì)胞表面呈奇特火山口樣外觀，①線粒體不腫脹，內(nèi)膜不破裂；②短暫滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ SEN）擴(kuò)張，擴(kuò)張間隙與細(xì)胞表面融合；③有時(shí)有聚積排例的半結(jié)晶狀核糖體；④可有與細(xì)胞表面平行的微絲束。 細(xì)胞周期 細(xì)胞周期：細(xì)胞前一次分裂結(jié)束開始至本次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的時(shí)相過程 .G0期：細(xì)胞不再沿周期進(jìn)行，進(jìn)入休眠狀態(tài)， G1期， DNA復(fù)制前期，主要進(jìn)行 RNA合成和蛋白質(zhì)合成，為染色體復(fù)制做準(zhǔn)備 ,S期 DNA復(fù)制期，完成 DNA復(fù)制 ,G2期 DNA復(fù)制后期，為紡錘絲的形成做準(zhǔn)備 ,M 期 :有絲分裂期。它是一種磷脂結(jié)合蛋白，可以與早期凋亡細(xì)胞的胞膜結(jié)合，而細(xì)胞質(zhì)膜的改變是細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)最早的改變之一，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜磷脂酰絲氨酸 (PS)由質(zhì)膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)， Annexin V與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，因而與細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合。有限細(xì)胞系在體外一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無限地傳代下去。 加入 %臺(tái)盼蘭染液，染色 2一 3分鐘。 加入一定比例一抗避光孵育 60min（如需孵育更長時(shí)間可以考慮在培養(yǎng)箱里保持濕潤避免干燥，如有必要?jiǎng)t在 4度冰箱中孵育過夜） %Ttitonx100TBSA洗幾次，后加FITC標(biāo)記的二抗室溫標(biāo)記 60min。若細(xì)胞之間有絲狀，管狀，樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。 （ 6） 防止細(xì)胞交叉污染 在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，做好做上標(biāo)記便于辨別。 預(yù)防用藥一般用雙抗青霉素100U/ml加鏈霉素 100Ug/ml，污染后用藥量為常用量的 10倍，用高濃度抗生素液反復(fù)清洗細(xì)胞，后用高濃度培養(yǎng)液培養(yǎng) 2448小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液 。此污染培養(yǎng)液會(huì)發(fā)生混濁， PH值會(huì)發(fā)生改變。 ? （ 4）棄離心上清，再緩緩加入 5ml固定液 4℃ 冰箱中固定 50分鐘，低速離心收集細(xì)胞。 ?細(xì)胞冷凍原理 在不加保護(hù)條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會(huì)形成結(jié)晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列變化，如電解質(zhì)濃度升高、滲透壓改變、脫水、等，能引起細(xì)胞死亡。取組織時(shí)應(yīng)嚴(yán)格保持無菌，同時(shí)也要避免接觸其他有害物質(zhì)。連續(xù)細(xì)胞系和