【正文】 途徑進(jìn)行修飾、改造，改變細(xì)胞特性，并與細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，為實(shí)現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來的一個(gè)新的學(xué)科領(lǐng)域。 某些 微生物生長所必需的有機(jī)物質(zhì)，但其需要量不大，通常把這些特殊的營養(yǎng)物質(zhì)稱為生長因子 。 此法可以避免酶反應(yīng)過程的底物抑制現(xiàn)象 ③ 連續(xù)式反應(yīng)器： 一邊連續(xù)地將底物溶液加入反應(yīng)器中，一邊連續(xù)地使反應(yīng)液以相同流量排出反應(yīng)器 。 ，各自具有什么特點(diǎn)？ ① KS 型不可逆抑制劑： 具有與底物類似的結(jié)構(gòu)，他們能與特 定的酶結(jié)合，它們的結(jié)構(gòu)中還帶有一個(gè)活潑的化學(xué)基團(tuán)，可以與酶分子中的必需基團(tuán)起反應(yīng)，使酶活力受到抑制 ② Kcat型不可逆抑制劑： 結(jié)構(gòu)中潛在著一種化學(xué)活性基團(tuán)，當(dāng)酶把它們作為一種底物來結(jié)合并在這一酶促催化作用進(jìn)行到一定階段以后，潛在的化學(xué)基團(tuán)被活化，成為有活性的化學(xué)基團(tuán)，并和酶蛋白活性中心發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使酶失活 ，酶反應(yīng)器可以分為哪幾類，各自具有什么特點(diǎn)？ ① 間歇式反應(yīng)器： 先把酶和底物一次性裝入反應(yīng)器，在適當(dāng)溫度、 PH 下反應(yīng)，經(jīng)一定時(shí)間后將全部反應(yīng)物取出 。 ? ① 競爭性抑制 ： 與底物結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)能在酶的活性部位與酶結(jié)合，使酶促反應(yīng)速率下降 ② 非競爭性抑制： 抑制劑可在酶的活性部位以外與酶結(jié)合，其結(jié)合與底物沒有 競爭關(guān)系 ③ 反競爭性抑制 ： 抑制劑 I 僅與復(fù)合物 ES 作用生成底物 酶 抑制劑復(fù)合物 SEI ？ 從一個(gè)或多個(gè)已存在的親本出發(fā)，利用 TaqDNA 多聚酶不具有 3‘→ 5‘校對功能，并結(jié)合基因工程現(xiàn)有技術(shù)，在待進(jìn)化的酶基因的 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，并構(gòu)建突變庫。由于擴(kuò)散阻力將導(dǎo)致 酶動力學(xué)行為改變而降低活力 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 11 ？ 殘留法、水解法 ？ 構(gòu)象效應(yīng)、屏蔽效應(yīng)（或稱位阻效應(yīng)）、微環(huán)境效應(yīng)（或稱分配效應(yīng)）、擴(kuò)散效應(yīng) ？ 分批測定法、連續(xù)測定法 ，固定化酶具有哪些優(yōu)點(diǎn)？ （ 1）穩(wěn)定性較天然酶高 （ 2）反應(yīng)后，酶與底物易于分開，并可長期反復(fù)使用 （ 3）反應(yīng)液中無殘留酶，產(chǎn)物易于純化，產(chǎn)品質(zhì)量高 （ 4）可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)連續(xù)化和自動化控制； （ 5）酶的利用效率高，產(chǎn)品成本低。 本法又分為（ 1）交聯(lián)酶法、（ 2）酶與輔助蛋白交聯(lián)法、（ 3）吸附交聯(lián)法、（ 4）載體交聯(lián)法 ④ 包埋法 ： 分為凝膠包埋法及微囊化包埋法兩類 優(yōu)點(diǎn)： 制備固定化酶的操作條件溫和，不改變酶的結(jié)構(gòu)，操作時(shí)保護(hù)劑及穩(wěn)定劑均不影響酶的包埋率，適用于多種酶、粗酶制劑、細(xì)胞器及細(xì)胞的固定化。 缺點(diǎn)： 載體需活化，固定化操作復(fù)雜，反應(yīng) 條件較劇烈，酶易失活并產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)。酶與載體之間結(jié)合力不強(qiáng)，酶易于脫落，導(dǎo)致酶活力下降并污染產(chǎn)物。 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡單，可選用帶不同電荷和不同形狀的載體，固定化過程可以與純化過程同時(shí)實(shí)現(xiàn)，酶失活后載體仍可再生。 三、 問答題 ？什么是酶工程？ 酶具有以下特性： 酶是蛋白質(zhì)； 酶的催化效率非常高 ； 酶具有高度的專一性； 酶的反應(yīng)條件溫和（常溫、常壓） ； 酶的催化活性受到調(diào)節(jié)和控制。 誘導(dǎo)法 、 引入法 、 拷貝法 和 抗體庫法 。 以固定化的 生物成分（如酶、蛋白質(zhì)、 DNA、抗體、抗原）或微生物體本身（如細(xì)胞、微生物、組織等）為敏感材料，與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)換能器相結(jié)合，用于快速檢測物理、化學(xué)、生物量的新型器件 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 10 酶在非水相（也稱為非水介質(zhì)）中也具有催化活性，可以在含有多種有機(jī)溶劑和微量水分的非水介質(zhì)中發(fā)揮催化作用 抗體酶又稱催化抗體（ catalytic antibody），是一類具有抗體的高度特異性又具有酶的高效催化活性的蛋白質(zhì)分子 能在極端環(huán)境中生長的微生物 叫做極端微生物。 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 9 酶工程 一、 專業(yè)符號及名詞解釋 1. NADPH 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 2. DEAE 二乙氨乙基葡聚糖 3. DNP 二硝基苯酚 4. error prone PCR 易錯(cuò) PCR 5. DNA shuffling DNA 改組 6. IU 酶活力國際單位 7. Katal 酶活力單位 8. 酶工程 指通過化學(xué)方法、酶學(xué)方法和 DNA 重組技術(shù)改善自然酶的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以提高酶的催化效率、降低成本并在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用的技術(shù) 9. 酶的活力單位 酶在最適條件下，單位時(shí)間內(nèi)，酶催化底物的減少量或產(chǎn)物的生成量 （ IU：指在特定條件下， 1min 內(nèi)生成 1μ mol 產(chǎn)物的酶量） 每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù) 酶的比活力 =酶活力單位數(shù) /毫克酶蛋白 （ Immobilized enzyme） 通過物理和化學(xué)的方法將酶束縛在一定空間內(nèi)且仍具有催化活性的酶 制劑 （ Immobilized cell） 指被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞，與固定化酶一起統(tǒng)稱為固定化生物催化劑。 PCR 反應(yīng)的必要條件 ：須知基因兩端的部分序列 PCR 反應(yīng)中的幾個(gè)關(guān)鍵因素 ： Taq DNA 聚合酶 ； 引物的長度 ； 模板 。 ：① 隨機(jī)酶切成較大的 DNA 片段（ 10~30Kb，平均 20Kb)，對這些片段進(jìn)行分離； ② 重組入適當(dāng)載體（噬菌體）； ③ 轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌（ )，擴(kuò)增，構(gòu)建成基因文庫；④ 從基因組文庫中篩選出含有目的基因組的重組子。 2． 基因工程新技術(shù) ：蛋白質(zhì)工程，反義藥物， RNAi 技術(shù)，新生物技術(shù)疫苗。 ） ？ ① 分離純化需改造的目的蛋白； ② 了解其一級結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)，了解其結(jié)構(gòu) 功能關(guān)系； ③獲 取編碼該蛋白的基因序列； ④ 設(shè)計(jì)改造方案； ⑤ 對基因序列進(jìn)行改造； ⑥ 將經(jīng)過改造的基因序列重組入表達(dá)載體，進(jìn)行表達(dá)；⑦分離純化表達(dá)產(chǎn)物，并對其功能進(jìn)行檢測。 （ 克服的方法是將 5?末端的磷酸修飾移去，其結(jié)果為暴露出的 5‘OH所取代。 C. DNA 接頭連接法 ：優(yōu)點(diǎn)： 一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。 DNA 片段的連接有哪些方法，各有什么特色？ A. 同聚物加尾法 : 優(yōu)點(diǎn)： 是 連接任 何兩段 DNA 分子的普遍性方法 ； 缺點(diǎn) ：插入的片段難以回收。 : ①通過組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白；②產(chǎn)生可分泌的蛋白質(zhì)；③以包含體的形式表達(dá)；④選擇合適的宿主表達(dá)系統(tǒng)。 ②用一串連的終止密碼，而不是只是一個(gè)終止生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 8 密碼，以保證翻譯有效終止 。但許多哺乳動物類細(xì)胞中外源基因的表達(dá)需要內(nèi)含子存在，如果在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)外源基因時(shí)，最好用基因組基因而非cDNA。 :真核細(xì)胞與原核細(xì)胞對遺傳密碼的偏倚性不同，在 不同表達(dá)系統(tǒng)中，使用偏倚性密碼 ，尤其對于基因編碼序列的 5′ 端使用偏倚性密碼，能有效提高表達(dá)效率 。 : ①首選 AUG 為起始密碼子；②正確的 SD 序列；③ SD序列與起始密碼子之間的距離以 9177。 的穩(wěn)定性與基因高效表達(dá)： ①利用 RNase 缺失的受體菌 。 命名原則：屬 —— 種 —— 株 —— 分離序號 例如： EcoRⅠ 屬： Escherichia 種： coli 株： R 分離序號：Ⅰ 第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二，第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫； 第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 cDNA 與載體的連接 。 cDNA 鏈的合成 。 RNA和 mRNA。 。 .缺點(diǎn)：必須對基因的結(jié)構(gòu)序列清楚。 。 ④ 基因組文庫法 :從基因組文庫所分離獲得的基因序列包含有內(nèi)含子，因此不能直接在原核細(xì)胞中表達(dá)，但更適合作為如轉(zhuǎn)基因動物等的真核表達(dá)系統(tǒng)。 ③ cDNA 文庫的建立與基因的分離 :是以 mRNA 為模版，用反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ) DNA 的方法。 ② 鳥槍法 (Shot gun) 又稱霰彈法 :：操作簡單，命中率較高 。 通過控制溶解溫度使富 A=T 區(qū)解鏈變性，而富 G≡ C 區(qū)仍維持雙鏈。 四、問答題 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 7 ？各有哪些特點(diǎn)？ ① 基因分離的物理方法 ： 根據(jù) DNA 分子的兩條鏈存在著 G≡ C， A=T 堿基配對。 : ① 有很高的拷貝數(shù)； ② 強(qiáng)大的啟動子，可保證外源基因的高效表達(dá)； ③ 可保證糖基化。 Col E1 質(zhì)粒載體 ； pSC101 質(zhì)粒載體 ； pBR322 質(zhì)粒載體 ； pUC 質(zhì)粒載體 ； λ噬菌體 DNA 克隆載體；科斯質(zhì)粒載體；單鏈 DNA 噬菌體 M13 載體。 ① 有效的轉(zhuǎn)錄起始； ② mRNA 的穩(wěn)定性； ③ 有效地翻譯啟始； ④ 遺傳密碼應(yīng)用的偏倚性； ⑤ mRNA 的加工； ⑥ mRNA 序列上終止密碼的選擇；⑦表達(dá)質(zhì)粒拷貝數(shù)及穩(wěn)定性；⑧外源基因的穩(wěn)定性。 基本步驟 ①獲得目的基因 ； ②在體外，將帶有目的基因的外源 DNA 片段連接到能自我復(fù)制并具有選擇性標(biāo)記的載體分子上，形成重組 DNA 分子；③將重組 DNA 分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，并與之一起增殖；④從大量細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得重組 DNA 分子的宿主細(xì)胞克?。虎輳倪@些篩選出來的宿主細(xì)胞克隆中，提取出已經(jīng)得到擴(kuò) 增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究用；⑥將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。小不同的外源性目的基因、載體分子量要小 ,載力要大 。 。 : DNA蛋白質(zhì)篩選法是用來專門檢測同 DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子的中的外源 DNA編碼一種能專門同某一特定 DNA 序列結(jié)合的 DNA 結(jié)合蛋白質(zhì) . 三、 填空題 : 。 接頭法（ adaptor） ： 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 6 是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。 IPTG 是一種乳糖類似物，再無乳糖的條件下，他可以誘導(dǎo)細(xì)胞合成半乳糖苷酶。該 Iq 突變基因可產(chǎn)生出 10 余倍超量的阻遏物。 ： 位點(diǎn)上核苷酸順序通常呈雙重旋轉(zhuǎn)對 稱結(jié)構(gòu)，即呈回文結(jié)構(gòu)。獲得具有新遺傳性狀的生物細(xì)胞的過程。 ： 所謂基因組文庫是將基因組 DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組 DNA片段隨機(jī)地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組 DNA 的所有序列。晚期