標(biāo)記物及其與抗原抗體的結(jié)合物制備-文庫吧資料
2025-01-24 20:29本頁面
【正文】 量要低 ?控制總反應(yīng)體積200μ l ?反應(yīng)時(shí)間 1分鐘～2分鐘 ?弱堿性反應(yīng)條件 二、放射性核素標(biāo)記結(jié)合物的純化 標(biāo)記反應(yīng)后形成的結(jié)合物不能直接使用，需去除游離 125I和其他雜質(zhì) 。 可通過還原裂解使其再生 。 SPDP交聯(lián)法優(yōu)點(diǎn) 對蛋白質(zhì)的伯胺基和脂肪族鏈上的游離巰基反應(yīng)敏感，專一性很強(qiáng)，反應(yīng)容易控制，可避免副反應(yīng) 。 將 DTP化的蛋白質(zhì)通過 TDE反應(yīng)，與含巰基的蛋白質(zhì)（ P2SH）進(jìn)行交聯(lián) 。 SPDP分子兩端分別含有對脂肪鏈上的巰基和伯氨基十分敏感，有專一作用的二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基，可將含巰基和氨基的兩種蛋白質(zhì)很容易地交聯(lián)起來；如果兩種蛋白質(zhì)不含巰基，可用 SPDP在其中一個蛋白質(zhì)分子中引入二硫吡啶基，然后再用二巰基蘇糖醇（ DTT）還原成游離巰基，最后使二者交聯(lián)起來。 N羥基琥珀酰亞胺活化法 蛋白質(zhì)分子羧基通過 N羥基琥珀亞酰胺活化，再與標(biāo)記物分子中的氨基偶聯(lián)形成酰胺鍵 。 戊二醛法 戊二醛分子中兩個醛基可分別與兩個相同或不同分子上的伯氨形成 Schiff 堿 , 將兩個生物大分子以五碳鏈的橋連接起來 。 原理簡單，反應(yīng)溫和，適用范圍廣； 副反應(yīng)較多 , 易發(fā)生多聚合和分子內(nèi)交聯(lián)，使交聯(lián)物的生物活性顯著下降 。 一、 均一的雙功能交聯(lián)劑 常用的 均一的雙功能交聯(lián)劑（ homobifunctional crosslinking reagent） 有戊二醛、碳二亞胺等 。 非均一的雙功能交聯(lián)劑，兩個反應(yīng)基團(tuán)不同，每個基團(tuán)可能于不同的條件下反應(yīng) 。 交聯(lián)劑類型 根據(jù)其兩個反應(yīng)基團(tuán)是否相同分為均一的和非均一的交聯(lián)試劑 。 其連接類型主要有 ： NH2與 NH2 、 NH2與 CO2H 、 SH與 SH 、 NH2與 SH 、糖基 (OH)與 NH2 、 C=O與 NH2 等 。 金溶膠顆粒的直徑取決于制備時(shí)加入的枸櫞酸三鈉量，保持其他條件不變，制備時(shí)加入不同劑量的檸檬酸三鈉可獲得不同粒徑的膠體金顆粒 。 根據(jù)還原劑類型以及還原作用的強(qiáng)弱，可以制備 ～ 150nm不等的膠體金顆粒 。 膠體金制備原理 膠體金是氯金酸 (HAuCl4)在還原劑的作用下，聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電荷的疏水膠溶液。 膠體金特性 具有膠體的多種特性 特別是對電解質(zhì)的敏感性，電解質(zhì)能破壞膠體金顆粒的外周水化層，從而打破膠體金的穩(wěn)定狀態(tài) 。 膠體金顆粒由一個基礎(chǔ)金核 (原子金 Au)及包圍在外的雙離子層構(gòu)成 (內(nèi)層為負(fù)離子層 AuCl2，外層是帶正電荷的 H+)。 化學(xué)修飾法 用含巰基的有機(jī)分子如二氫硫辛酸、巰基乙酸和聚乙二醇等對量子點(diǎn)進(jìn)行表面修飾 。 量子點(diǎn)表面修飾 無機(jī)殼層修飾法和化學(xué)修飾法是兩種常用的量子點(diǎn)修飾方法 。 量子點(diǎn)分散性好、穩(wěn)定性高、不易沉積，但水溶性太差 。 物理制備法 可制得粒徑易控的量子點(diǎn)，但所需實(shí)驗(yàn)設(shè)備昂貴，廣泛使用受限 。 激發(fā)光波長寬，而發(fā)射光波長窄 量子點(diǎn)的激發(fā)光波長范圍很寬，具有較大的 Stokes位移和狹窄對稱的熒光譜峰 。有機(jī)熒光色素的光漂白速率很快，而量子點(diǎn)的光漂白作用則小得多 。 廣義的量子點(diǎn)還包括 IVVI 族、 VVI 族元素組成的納米晶，以及金簇、銀簇、硅點(diǎn)、碳點(diǎn)、復(fù)合型熒光納米顆粒等 。 魯米諾及其衍生物 AMPPD 魯米諾及其衍生物 魯米諾發(fā)光原理 魯米諾及其衍生物 魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理 AMPPD AMPPD 〔 3(2’ 螺旋金剛烷 )4甲氧基 4(3” 磷酰氧基 )苯 1,2二氧雜環(huán)丁烷 〕〕 五、量子點(diǎn) 量子點(diǎn) QDs 量子點(diǎn) (quantimim dots, QDs)即半導(dǎo)體納米粒子，是指半徑小于或接近于激子玻爾半徑的半導(dǎo)體納米晶粒（110nm） 。 電化學(xué)發(fā)光劑 是指通過在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)。 極其穩(wěn)定，如 2甲基吖啶酯，因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其有效期長達(dá) 1 年甚至更久 。在堿性介質(zhì)中氧化時(shí)，這些化合物經(jīng)歷共價(jià)鍵的斷裂，經(jīng)過一個二氧酮的中間體，產(chǎn)生電激發(fā)的 N甲基吖啶酮，當(dāng)它恢復(fù)到基態(tài)時(shí)，在 430nm出釋放出光子。 直接化學(xué)發(fā)光劑 酶促反應(yīng)發(fā)光劑 直接化學(xué)發(fā)光劑 直接化學(xué)發(fā)光劑 直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。 常用 4甲基傘酮基 β D半乳糖（ 4methylumbelliferyβ Dgalactoside， 4MUG）作為底物，酶促反應(yīng)后，產(chǎn)生高強(qiáng)度熒光物質(zhì) 4甲基傘形酮（4MU） 。 常用底物 BCIP/ NBT常用于 ELISPOT中的 PVDF膜顯色，在 ALP的催化作用下， BCIP被水解生成強(qiáng)反應(yīng)性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物與 NBT發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色沉淀 4MUP被 AP催化生成 4甲基傘形酮，在 360nm的激發(fā)光的作用下，發(fā)出 450nm的熒光，可用熒光光度計(jì)進(jìn)行測量。 H2O2 HRP +熒 光 C O O HH O C HC O O HH O C H 22氧化二聚體 ALP底物 常用的 ALP色原底物 對 硝基苯磷酸鹽（ pnitrophenyl phosphate， PNP） 氯化硝基四氮唑藍(lán) / 5溴 4氯 3吲哚 磷酸鹽（nitro bluetetrazolium/5bromo4chloro3 indolyl phosphate， BCIP/ NBT） 4甲基傘形酮磷酸鹽（ 4methylumbelliferyl phosphate， 4MUP）是 ALP的發(fā)光底物之一 。 TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色 ，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色 ,測定波長450nm ，穩(wěn)定，無致癌性， ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。 辣根過氧化物酶 HRP 辣根過氧化物酶（ HRP） 糖蛋白（主酶） 亞鐵血紅
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