【正文】 5 核酸 104 104～ 105 105～ 2 106 15～ 20 5～ 10 2～ 67 2022/5/26 67 聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn) 1. 化學(xué)惰性好，電泳時(shí)不會(huì)產(chǎn)生“電滲”； 2. 凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑； 3. 電泳分離的重復(fù)性好； 4. 機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存； 5. 化學(xué)性能穩(wěn)定，不與被分離物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，對(duì)溫度和pH變化較穩(wěn)定； 6. 凝膠無色透明，易觀察，有利于電泳后進(jìn)行各種處理； 7. 設(shè)備簡單，所需樣品量少（ 1 μg～ 100 μg）； 8. 分辨率較高，應(yīng)用范圍廣。 （五）電滲作用 在電場(chǎng)作用下液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲（ electroosmosis）。 為了使溶液 pH在電泳過程中恒定，必須使用緩沖溶液作為電極液。 常壓電泳（ 100 V～ 500 V）和高壓電泳（ 500 V～ 10000V）。 （二）電場(chǎng)強(qiáng)度 電場(chǎng)強(qiáng)度愈大，則帶電粒子的移動(dòng)愈快。 （二）分類 ? 有支持體的電泳 ? 無支持體的電泳技術(shù) 63 2022/5/26 63 二、影響泳動(dòng)速度的因素 （一） 帶電顆粒的性質(zhì) 顆粒所帶的電荷量、直徑大小和形狀都對(duì)電泳有影響。 ? 電泳技術(shù)具有設(shè)備簡單、操作方便、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于生物化學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、藥學(xué)和環(huán)保等學(xué)科中 62 2022/5/26 62 一、基本原理和分類 （一） 基本原理 ? 不同物質(zhì)由于帶電性質(zhì)的不同，在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下移動(dòng)的方向和速度不同。 ? 許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸等都具有可電離基團(tuán)，它們?cè)谝欢?pH下，可以解離成帶正或負(fù)電荷的顆粒，在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移。 4. 配體應(yīng)具有 較好的穩(wěn)定性 ，能夠耐受偶聯(lián)以及洗脫時(shí)可能的較劇烈的條件，可以多次重復(fù)使用。 2. 配體與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有 較強(qiáng)的特異性 ，不與其它組分有非特異性吸附作用。 常用的載體有纖維素、 瓊脂糖凝膠 、交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和多孔玻璃等。機(jī)械性能好，具有一定的顆粒形式以保持一定的流速。 ，而且容易和配體結(jié)合，不改變載體和配體的基本性質(zhì)。 54 2022/5/26 54 55 2022/5/26 55 二、載體和配體的選擇 （一） 載體 理想的載體應(yīng)具備以下特性： ，使固相配體易與水溶液中的生物大分子物質(zhì)接近。 ? 配體本身必須有兩個(gè)基團(tuán)： 一個(gè)能與載體共價(jià)結(jié)合，連接后的配體對(duì)互補(bǔ)分子的親和力不會(huì)改變 一個(gè)能與被親和分子結(jié)合。 51 2022/5/26 51 52 2022/5/26 52 第五節(jié) 親和層析法 ? 親和層析是利用某些生物分子之間專一可逆結(jié)合特性的一種高度專一的吸附層析類型。 50 2022/5/26 50 二、常用凝膠 ?凝膠是一類不溶于水，在水中有較大膨脹度和較好分子篩功能的化合物。 49 2022/5/26 49 ?如果兩種以上不同相對(duì)分子質(zhì)量的分子都能進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔，但由于它們被排阻和擴(kuò)散的程度不同，在凝膠柱中所經(jīng)過的路程和時(shí)間也不同，從而彼此也可以分離開來。 （ 4）大小分子完全分開 。 （ 2）洗脫開始，小分子擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，大分子則被排阻于顆粒之外 。 46 2022/5/26 46 47 2022/5/26 47 凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多空網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、呈珠狀顆粒的物質(zhì)，每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，像篩子，小的分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而大的分子則排阻于顆粒之外。 45 2022/5/26 45 第四節(jié) 凝膠層析（ gel chromatography） 凝膠排阻層析（ gel exclusion chromatography） 分子篩層析（ molecular sieve chromatography） ? 是以各種多孔凝膠為固定相，當(dāng)混合物隨流動(dòng)相經(jīng)過凝膠層析柱時(shí)，其中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。但弱堿型離子交換劑的交換容量隨著 pH的下降而增大。 43 2022/5/26 43 二、常用的離子交換劑種類和性質(zhì) ?疏水性離子交換劑 ? 是一種人工合成的、與水結(jié)合力較小的樹脂 ? 陽離子交換劑、陰離子交換劑（包括強(qiáng)、中、弱三種離子交換基團(tuán)） ?親水性離子交換劑 ? 纖維素離子交換劑 ? 交聯(lián)葡聚糖離子交換劑 ? 瓊脂糖離子交換劑 ? 陽離子交換劑、陰離子交換劑（包括強(qiáng)、中、弱三種離子交換基團(tuán)） 44 2022/5/26 44 四、影響交換容量的因素 ?① 離子交換劑顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及分離的樣品組分的質(zhì)量大?。? 一般離子交換劑的孔隙應(yīng)盡量讓樣品組分進(jìn)入，使樣品組分與離子交換劑作用面積增大。 ? 用一定鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來。 （三）洗脫和收集 ? 洗脫可采用改變?nèi)芤旱?pH或離子強(qiáng)度，也可同時(shí)改變 pH與離子強(qiáng)度的方法。 （二）裝柱和加樣 ? 選擇平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和 pH時(shí)，首先要保證待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；其次是使離子交換劑與待分離物質(zhì)有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，而不與樣品中雜質(zhì)結(jié)合，以達(dá)到分離的目的。 ? 大多數(shù)蛋白在生理 pH（ pH6～ 8）下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的 pH下蛋白會(huì)變性失活，應(yīng)盡量避免。 ?用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來。 ?洗脫可采用改變?nèi)芤旱?pH或離子強(qiáng)度，也可同時(shí)改變 pH與離子強(qiáng)度的方法。 39 2022/5/26 39 40 2022/5/26 40 ?兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定 pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。 ?含有預(yù)被分離的離子的溶液通過離子交換柱時(shí)，各種離子即與離子交換劑上的荷電部位競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。 一、 基本原理 37 2022/5/26 37 陽離子交換反應(yīng)： RA H+ + Y+ —RA X+ + H+ 陰離子交換反應(yīng)： RB+ OH + X —RB+ X + OH ? R代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì)， ? A 和 B+分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合的電荷基團(tuán)， ? H+ 和 OH分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子， ? Y+ 和 X分別代表溶液中的離子基團(tuán)。 這些被固相單體所吸附的離子，統(tǒng)稱為 counter ion，因?yàn)槠潆姾膳c擔(dān)體上的電荷相反 (counter 是 相反 的意思 ) 離子交換劑為人工合成的惰性高分子聚合物，其上帶有許多可電離基團(tuán)，根據(jù)這些基團(tuán)所帶電荷的不同，可分為陰離子交換劑和陽離子交換劑。 35 2022/5/26 35 優(yōu)點(diǎn)： ①重現(xiàn)性好，簡單易行； ②分辨力強(qiáng)，回收率高； ③具有多孔性，表面積大、交換容量大； ④具有親水性，對(duì)大分子的吸附不牢固，層析條件溫和，不致引起物質(zhì)變性或失活。 33 2022/5/26 33 ? 常用吸附法、乙醇沉淀法、或鹽析法除去沉淀物中大量的聚乙二醇 第三節(jié) 離子交換層析法 （ ion exchange chromatography， IEC） 是利用離子交換劑上可交換離子與組分中的離子發(fā)生可逆交換時(shí)結(jié)合力的差別，而進(jìn)行分離的一種技術(shù)。 ⑤ PEG聚合