標(biāo)記物及其與抗原抗體的結(jié)合物制備(參考版)
2025-01-21 20:29本頁(yè)面
【正文】 Thank you ! 。 本章小結(jié) 標(biāo)記結(jié)合物的純化方法主要有凝膠柱層析、透析、硫酸銨沉淀法、離心法等，也可以采用高效液相層析、電泳及離子交換柱層析進(jìn)行分離純化 。 根據(jù)其兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)是否相同分為均一的和非均一的交聯(lián)試劑。 量子點(diǎn)由 IIVI族或 IIIV族元素組成，其光學(xué)特性為：激發(fā)光譜寬而連續(xù)、發(fā)射光譜窄而對(duì)稱，發(fā)光效率高、光化學(xué)穩(wěn)定性好，發(fā)射光顏色與粒徑大小關(guān)聯(lián)等 。 本章小結(jié) 臨床免疫分析技術(shù)常用的標(biāo)記物有放射性核素、熒光素、酶、化學(xué)發(fā)光劑、膠體金、量子點(diǎn)、三價(jià)稀土離子等 。 二、 膠體金標(biāo)記結(jié)合物的純化 、鑒定 除去未標(biāo)記的蛋白、未充分標(biāo)記的膠體金以及在標(biāo)記過程中形成的聚合物，可采用超速離心法或凝膠過濾法 。 吸附的可能機(jī)理是膠體金顆粒具有高電子高密度的特性，其表面的負(fù)電荷能與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)靜電吸附而牢固結(jié)合 。 G100葡聚糖凝膠柱可證實(shí)結(jié)合物偶聯(lián)的有效性 。 偶聯(lián)前后量子點(diǎn)的紫外 可見吸收光譜和熒光光譜特征的變化、 SDSPAGE凝膠電泳、熒光鏡下成像等，可證明結(jié)合物偶聯(lián)成功 。 不同偶聯(lián)比例量子點(diǎn)探針的分離，可根據(jù)顆粒大小不同，其進(jìn)一步純化可以采用凝膠過濾法、高效液相色譜等方法進(jìn)行分離 。 多余的抗體可采用凝膠柱層析法或 50%飽和硫酸銨沉淀提純法去除 。 表面功能基團(tuán)為羥基的量子點(diǎn)偶聯(lián)主要通過琥珀酸酐法實(shí)現(xiàn) 。 量子點(diǎn)表面含有羧基的偶聯(lián)方法主要是混合酸酐法和碳二亞胺法 。 第八節(jié) 量子點(diǎn)與抗原抗體結(jié)合物制備 一、 基本方法 量子點(diǎn)與抗原、抗體等生物分子偶聯(lián)的方法主要有 靜電吸附法、生物素 親和素法及共價(jià)結(jié)合法 。 螯合劑可先螯合 EU3+，再連接蛋白質(zhì)（一步法），或先連接蛋白質(zhì)，再螯合 EU3+(二步法 )。 第七節(jié) 稀土離子與抗原抗體的結(jié)合物制備 一、基本方法 鑭系元素離子不能直接與抗原或抗體分子結(jié)合，需利用具有雙功能基團(tuán)的螯合劑 。 三、 化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記結(jié)合物的鑒定 由于標(biāo)記過程的不規(guī)范或存放過程中可能出現(xiàn)的脫落現(xiàn)象，對(duì)新制備已純化或經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間保存的結(jié)合物，在使用前均需測(cè)定蛋白質(zhì)的含量、免疫學(xué)活性和發(fā)光效率等三項(xiàng)指標(biāo)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠 。 間接偶聯(lián)是通過交聯(lián)劑在標(biāo)記物和被標(biāo)記物之間插入一條鏈或一個(gè)基團(tuán)，通過 “ 橋 ” 可以在原有結(jié)構(gòu)中引進(jìn)新的活性基團(tuán)，增加反應(yīng)活性，減弱偶聯(lián)雙方分子結(jié)構(gòu)中存在的空間阻礙效應(yīng) 。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長(zhǎng)時(shí)間保存。 四、酶標(biāo)記結(jié)合物的保存 酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，極易失活。 沉淀線經(jīng)生理鹽水反復(fù)漂洗后，滴加的底物溶液，若能在沉淀線上顯色，則表示酶標(biāo)記物中的酶仍具有活性。 常用的純化方法： 葡聚糖凝膠 G200/G150過柱層析純化 50%飽和硫酸銨沉淀提純 三、酶標(biāo)記結(jié)合物鑒定 每批制備的酶標(biāo)記物都要進(jìn)行質(zhì)量和標(biāo)記率的鑒定，質(zhì)量鑒定包括酶活性和抗體（抗原）的免疫活性的鑒定 。 為防止酶蛋白分子中氨基與醛基發(fā)生自身偶聯(lián)反應(yīng)，標(biāo)記前需用 2,4二硝基氟苯封閉酶蛋白分子中殘存的 α 氨基和ε 氨基 。 改良過碘酸鈉法 此法是目前用于 HRP標(biāo)記抗體或抗原的最常用方法 。 戊二醛交聯(lián)法 二步法則是將相對(duì)過量的戊二醛與酶反應(yīng)，讓酶分子上的氨基僅與戊二醛上的醛基結(jié)合，不發(fā)生酶與酶之間的結(jié)合，除去未與酶結(jié)合的多余戊二醛后，再加入抗體 (抗原 )，形成酶 戊二醛 抗體 (抗原 )結(jié)合物。此法操作簡(jiǎn)便，可用于 HRP、 ALP標(biāo)記抗體 (抗原 )。 戊二醛法又根據(jù)試劑加入的方法分為一步法和二步法。二步法標(biāo)記效率比一步法高，酶標(biāo)記物質(zhì)量較均一。 一、基本方法 制備方法 過碘酸鈉法（直接法） 常用于 HRP標(biāo)記抗體或抗原 戊二醛交聯(lián)法 戊二醛分子中有兩個(gè)相同的醛基，可分別與 HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。 交聯(lián)方法主要有：戊二醛法、酶醛化法、重氮化法、碳二亞胺法、混合酸酐法等 。本法簡(jiǎn)便快捷，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成 。 透析法 將標(biāo)記的抗體放入透析袋中，不斷更換透析液透析 1周左右，直至透析液在紫外燈照射下不發(fā)出熒光為止，本法適用于蛋白含量低的標(biāo)記物。標(biāo)記比較勻，非特異染色較低。標(biāo)記時(shí)間短，熒光素用量少，但有非特異性染色。 FITC標(biāo)記結(jié)合物制備 熒光素標(biāo)記抗體的方法 原理 :利用抗體蛋白的 自由氨基 與 FITC的 異硫氰基在堿性溶液中形成 硫碳酰胺鍵 ，使抗體與 FITC結(jié)合成熒光抗體。 異硫氰酸和重氮鹽類，這兩種通常由相應(yīng)的胺制備，通過化學(xué)鍵作用于相應(yīng)的抗原、抗體反應(yīng)結(jié)合 。標(biāo)記物長(zhǎng)期貯存后可因脫碘和自身輻射造成蛋白質(zhì)破壞而形成碎片，同樣可以采用上述方法對(duì)標(biāo)記物重新進(jìn)行純化。 125I結(jié)合物鑒定 標(biāo)記物質(zhì)量 ?高純度 ?高比放射活性 ?完整免疫活性 放射化學(xué)純度 ?單位標(biāo)記物中結(jié)合于抗原或抗體上的放射活性占該標(biāo)記物總放射性的百分比 ?應(yīng)大于 95% 免疫活性（ immunoreactivity） ?標(biāo)記物與抗原或抗體結(jié)合的能力 ?標(biāo)記物與過量抗體反應(yīng)百分比 ?該值越大 , 標(biāo)記物免疫活性好 四、放射性核素標(biāo)記結(jié)合物的保存 放射性核素標(biāo)記結(jié)合物在 2~8℃ 避光保存。 免疫活性指標(biāo)記物與抗原或抗體反應(yīng)的能力。 125I結(jié)合物純化 ?凝膠過濾法 ?離子交換層析法 ?聚丙烯酰胺凝膠電泳 ?高效液相色譜法 ?去除游離 125I ?去除過度標(biāo)記的標(biāo)記物 三、放射性核素標(biāo)記結(jié)合物的鑒定 放射性核素結(jié)合物的鑒定包括放射化學(xué)純度、比放射活性和免疫活性三個(gè)參數(shù) ： 放射化學(xué)純度指在標(biāo)記物中結(jié)合在抗原（或抗體）上的放射活性占該標(biāo)記物總放射活性的百分比 。 125I ChT氧化 125I或 125I+ 取代反應(yīng) 125I標(biāo)記物 （混合物） 氯胺 T(chT)法 ?使用無(wú)還原劑的高比放射性碘源 ?chT用
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