標記物及其與抗原抗體的結(jié)合物制備(編輯修改稿)
2025-02-14 20:29 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 收性也不同 最小的膠體金 (2nm～ 5nm)是橙黃色，中等大小膠體金(10nm～ 20nm)是酒紅色，較大顆粒膠體金 (30nm～ 80nm)則是紫紅色 。 膠體金制備原理 膠體金是氯金酸 (HAuCl4)在還原劑的作用下，聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電荷的疏水膠溶液。 常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、維生素 C、白磷、硼氫化鈉等 。 根據(jù)還原劑類型以及還原作用的強弱，可以制備 ～ 150nm不等的膠體金顆粒 。 膠體金制備方法 常用的方法為檸檬酸三鈉還原法 以制備 16nm的膠體金為例，取 %的氯金酸水溶液100ml，加熱至沸騰，磁力攪動下加入 1%的檸檬酸三鈉水溶液 2ml，淡黃色的氯金酸溶液很快變灰色，繼而黑色，隨后成酒紅色。 金溶膠顆粒的直徑取決于制備時加入的枸櫞酸三鈉量，保持其他條件不變，制備時加入不同劑量的檸檬酸三鈉可獲得不同粒徑的膠體金顆粒 。 第二節(jié) 常用交聯(lián)劑及特性 重點提示 均一的雙功能交聯(lián)劑 非均一的雙功能交聯(lián)劑 交聯(lián)劑方法 交聯(lián)劑 生物大分子之間的偶聯(lián)，本質(zhì)上是生物大分子中活性基團之間的連接 。 其連接類型主要有 ： NH2與 NH2 、 NH2與 CO2H 、 SH與 SH 、 NH2與 SH 、糖基 (OH)與 NH2 、 C=O與 NH2 等 。 免疫標記常用交聯(lián)劑 分子兩端各有一個相同或者不同的活性基團，它們可與其它分子上的氨基、巰基、羥基等基團發(fā)生共價結(jié)合而產(chǎn)生交聯(lián)作用 。 交聯(lián)劑類型 根據(jù)其兩個反應(yīng)基團是否相同分為均一的和非均一的交聯(lián)試劑 。 均一的雙功能交聯(lián)劑，其兩個反應(yīng)基團相同 。 非均一的雙功能交聯(lián)劑，兩個反應(yīng)基團不同，每個基團可能于不同的條件下反應(yīng) 。 大分子抗原、抗體的標記是利用雙功能交聯(lián)劑使標記物與被標記物結(jié)構(gòu)中的游離的氨基、羧基、硫氫基、咪唑基、酚基、羥基等基團形成不可逆連接 。 一、 均一的雙功能交聯(lián)劑 常用的 均一的雙功能交聯(lián)劑（ homobifunctional crosslinking reagent） 有戊二醛、碳二亞胺等 。 有 CHO 、 N=C=O 、 N=C=S 、 SO2CH =CH2 等活潑雙鍵, 可與生物大分子中的 NH2 、 OH 、 SH 等進行交聯(lián)反應(yīng)。 原理簡單，反應(yīng)溫和，適用范圍廣； 副反應(yīng)較多 , 易發(fā)生多聚合和分子內(nèi)交聯(lián)，使交聯(lián)物的生物活性顯著下降 。 碳二亞胺縮合法 碳二亞胺能激活蛋白質(zhì)分子上的羧基，反應(yīng)生成一個肽鍵（ CONH），經(jīng)碳二亞胺縮合反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中的游離羧基與標記物分子中的氨基形成較穩(wěn)定的酰胺鍵 。 戊二醛法 戊二醛分子中兩個醛基可分別與兩個相同或不同分子上的伯氨形成 Schiff 堿 , 將兩個生物大分子以五碳鏈的橋連接起來 。 過碘酸鈉氧化法 利用過碘酸鹽氧化糖蛋白中糖基的鄰二羥基成為醛基，再通過醛基與標記物分子中的伯氨基反應(yīng)形成schiff堿，后者經(jīng) NaBH4還原 — N＝ C— 鍵成為穩(wěn)定的結(jié)合物 。 N羥基琥珀酰亞胺活化法 蛋白質(zhì)分子羧基通過 N羥基琥珀亞酰胺活化，再與標記物分子中的氨基偶聯(lián)形成酰胺鍵 。 非均一的雙功能交聯(lián)劑 N琥珀酰亞胺基 3(2吡啶基二硫 )丙酸醋 (SPDP)等屬于 非均一雙功能交聯(lián)劑 (heterobifunctional crosslinking reagent)。 SPDP分子兩端分別含有對脂肪鏈上的巰基和伯氨基十分敏感，有專一作用的二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基，可將含巰基和氨基的兩種蛋白質(zhì)很容易地交聯(lián)起來；如果兩種蛋白質(zhì)不含巰基，可用 SPDP在其中一個蛋白質(zhì)分子中引入二硫吡啶基，然后再用二巰基蘇糖醇（ DTT）還原成游離巰基，最后使二者交聯(lián)起來。 SPDP分子結(jié)構(gòu)式 SPDP交聯(lián)原理 將蛋白質(zhì)（ P1NH2）通過酰胺化學(xué)反應(yīng)，引入二硫吡啶基（ DTP） 。 將 DTP化的蛋白質(zhì)通過 TDE反應(yīng)，與含巰基的蛋白質(zhì)（ P2SH）進行交聯(lián) 。 如果第二種蛋白質(zhì)分子（ P2）不含巰基，可按反應(yīng)（ 1）而得到 P2NHDTP，再與二巰基蘇糖醇（ DTT）起反應(yīng)，將 DTP基還原成巰基，所得 P2NHCOCH2CH2SH，再按反應(yīng)（ 2）方式交聯(lián)，制得結(jié)合物 II（ P1NHCOCH2CH2SSCH2CH2CONHP2） 。 SPDP交聯(lián)法優(yōu)點 對蛋白質(zhì)的伯胺基和脂肪族鏈上的游離巰基反應(yīng)敏感，專一性很強，反應(yīng)容易控制，可避免副反應(yīng) 。 交聯(lián)的程度容易測定，交聯(lián)后的大分子生物活性高于一般交聯(lián)劑方法 。 可通過還原裂解使其再生 。 第三節(jié) 放射性核素與抗原抗體結(jié)合物的制備 重點提示 標記物與抗原抗體結(jié)合物的制備基本方法 標記物與抗原抗體結(jié)合物的純化 標記物與抗原抗體結(jié)合物的鑒定 標記物與抗原抗體結(jié)合物的保存 放射性核素與抗原抗體的結(jié)合物制備 一、 基本方法 氯胺 T(chT)法是常用的標記方法，氯胺 T是一種氧化劑，它能使 125I+液中帶負電荷的碘離子氧化成帶正電荷的碘，然后取代抗原酪氨酸殘基芳香環(huán)上的氫 chT是對甲苯磺基酰胺的 N氯衍生物鈉鹽，在水中易分解成具氧化性的次氯酸：次氯酸可將 125I﹣ 氧化成帶正電荷的125I+，后者可取代抗原（或抗體）中酪氨酸殘基苯環(huán)上的氫原子，形成穩(wěn)定放射標記物；最后加入還原劑偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）可終止反應(yīng) 125I結(jié)合物制備 直接標記法 — 氯胺 T法 化學(xué)或酶促反應(yīng)，將放 射性負電碘離子氧化成 碘原子或正電碘離子， 通過 取代反應(yīng) 置換被標 記物分子中 酪氨酸或酪 胺殘基以及組胺殘基上 的氫原子。 125I ChT氧化 125I或 125I+ 取代反應(yīng) 125I標記物 （混合物） 氯胺 T(chT)法 ?使用無還原劑的高比放射性碘源 ?chT用量要低 ?控制總反應(yīng)體積200μ l ?反應(yīng)時間 1分鐘～2分鐘 ?弱堿性反應(yīng)條件
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