【正文】 特異性染色強度。 常用的純化方法： 葡聚糖凝膠 G200/G150過柱層析純化 50%飽和硫酸銨沉淀提純 三、酶標記結合物鑒定 每批制備的酶標記物都要進行質量和標記率的鑒定，質量鑒定包括酶活性和抗體（抗原）的免疫活性的鑒定 。 常用的鑒定方法 ： 免疫電泳或雙相擴散法 常用免疫電泳或雙向擴散法，出現(xiàn)沉淀線表示酶標記物中的抗體（抗原）具有免疫活性 。 沉淀線經(jīng)生理鹽水反復漂洗后，滴加的底物溶液，若能在沉淀線上顯色，則表示酶標記物中的酶仍具有活性。 也可直接用 ELSIA方法測定 酶標記率測定常用分光光度計法分別測定酶標記物中酶和抗體（抗原）蛋白的含量，再用公式計算其標記率 。 四、酶標記結合物的保存 酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質，保存不當，極易失活。高濃度的結合物較為穩(wěn)定，冷凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經(jīng)復融。結合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時間保存。 第六節(jié) 化學發(fā)光劑與抗原抗體的結合物制備 一、基本方法 化學發(fā)光劑 標記反應分為直接偶聯(lián)和間接偶聯(lián)兩種方式 ： 直接偶聯(lián)是通過偶聯(lián)反應，使標記物分子中的發(fā)光集團直接連接到被標記物分子的反應基團上 。 間接偶聯(lián)是通過交聯(lián)劑在標記物和被標記物之間插入一條鏈或一個基團，通過 “ 橋 ” 可以在原有結構中引進新的活性基團，增加反應活性，減弱偶聯(lián)雙方分子結構中存在的空間阻礙效應 。 二、 化學發(fā)光劑標記結合物的純化 多數(shù)經(jīng)偶聯(lián)反應制備的結合物，使用前需采用透析法、凝膠過濾法或鹽析沉淀法等進行純化，目的是除去反應系統(tǒng)中存在的未結合的發(fā)光劑和交聯(lián)劑 。 三、 化學發(fā)光劑標記結合物的鑒定 由于標記過程的不規(guī)范或存放過程中可能出現(xiàn)的脫落現(xiàn)象，對新制備已純化或經(jīng)長時間保存的結合物，在使用前均需測定蛋白質的含量、免疫學活性和發(fā)光效率等三項指標，以保證實驗結果準確、可靠 。 四、化學發(fā)光劑標記結合物的保存 結合物一般可分裝保存在 70~4℃ 條件下，最好冷凍干燥保存，這樣可保存數(shù)年之久不喪失活性。 第七節(jié) 稀土離子與抗原抗體的結合物制備 一、基本方法 鑭系元素離子不能直接與抗原或抗體分子結合，需利用具有雙功能基團的螯合劑 。 常用的雙功能螯合劑有 1（對 苯偶氮） EDTA、異硫氰酸苯基 EDTA、異硫氰酸苯甲基 EDTA和二乙烯三胺五乙酸（ DTPA）等 。 螯合劑可先螯合 EU3+，再連接蛋白質（一步法），或先連接蛋白質，再螯合 EU3+(二步法 )。針對小分子半抗原，則需先將半抗原與大分子載體蛋白（牛血清白蛋白、多聚賴氨酸等）連接，再標記 EU3+。 第八節(jié) 量子點與抗原抗體結合物制備 一、 基本方法 量子點與抗原、抗體等生物分子偶聯(lián)的方法主要有 靜電吸附法、生物素 親和素法及共價結合法 。 共價結合法亦稱雙功能交聯(lián)試劑法 ，通過化學反應將量子點表面進行羧基、氨基、羥基或環(huán)氧基等活性基團修飾改性，使之能與生物分子共價偶聯(lián) 。 量子點表面含有羧基的偶聯(lián)方法主要是混合酸酐法和碳二亞胺法 。 含有氨基的偶聯(lián)方法主要是戊二醛法 。 表面功能基團為羥基的量子點偶聯(lián)主要通過琥珀酸酐法實現(xiàn) 。 二、 量子點標記結合物的純化 純化目的主要是：除去多余的交聯(lián)劑、未交聯(lián)的抗體以及未結合的量子點 。 多余的抗體可采用凝膠柱層析法或 50%飽和硫酸銨沉淀提純法去除 。 溶液中未反應的小分子，如偶聯(lián)劑、抗體、量子點分解產(chǎn)物等可采用透析法去除 。 不同偶聯(lián)比例量子點探針的分離，可根據(jù)顆粒大小不同，其進一步純化可以采用凝膠過濾法、高效液相色譜等方法進行分離 。 三、量子點標記結合物的鑒定 量子點與抗原抗體結合物的鑒定可從光譜學特征、凝膠電泳、熒光成像、凝膠柱層析、點印記親和分析等方面展開。 偶聯(lián)前后量子點的紫外 可見吸收光譜和熒光光譜特征的變化、 SDSPAGE凝膠電泳、熒光鏡下成像等，可證明結合物偶聯(lián)成功 。 點印記親和分析等抗原抗體結合試驗可證明結合物免疫活性 。 G100葡聚糖凝膠柱可證實結合物偶聯(lián)的有效性 。 第九節(jié) 膠體金與抗原抗體的結合物制備 一、 基本方法 膠體金標記就是蛋白質等大分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程 。 吸附的可能機理是膠體金顆粒具有高電子高密度的特性，其表面的負電荷能與蛋白質的正電荷基團靜電吸附而牢固結合 。 這種結合過程主要是物理吸附作用，不影響被標記分子的生物活性 。 二、 膠體金標記結合物的純化 、鑒定 除去未標記的蛋白、未充分標記的膠體金以及在標記過程中形成的聚合物，可采用超速離心法或凝膠過濾法 。 一是用有支持膜的鎳網(wǎng)蘸取膠體金標記蛋白，在電鏡下測量顆粒的平均直徑；二是用免疫組化濾紙模型鑒定特異性和敏感性 。 本章小結 臨床免疫分析技術常用的標記物有放射性核素、熒光素、酶、化學發(fā)光劑、膠體金、量子點、三價稀土離子等 。 三價稀土離子銪是標記抗原抗體應用最廣的鑭系元素，其特性為有較大的 Stokes位移，熒光壽命長 。 量子點由 IIVI族或 IIIV族元素組成，其光學特性為：激發(fā)光譜寬而連續(xù)、發(fā)射光譜窄而對稱，發(fā)光效率高、光化學穩(wěn)定性好，發(fā)射光顏色與粒徑大小關聯(lián)等 。 本章小結 交聯(lián)劑分子兩端各有一個相同或者不同的活性基團，它們可與其他分子上的氨基、巰基、羥基等基團發(fā)生共價結合而產(chǎn)生交聯(lián)作用 。 根據(jù)其兩個反應基團是否相同分為均一的和非均一的交聯(lián)試劑。 常用的雙功能交聯(lián)法有：碳二亞胺縮合法、戊二醛法、 N羥基琥珀亞酰胺活化法、混合酸酐法、過碘酸鹽氧化法、 N琥珀酰亞胺基 3(2吡啶基二硫 )丙酸醋(SPDP)法等 。 本章小結 標記結合物的純化方法主要有凝膠柱層析、透析、硫酸銨沉淀法、離心法等，也可以采用高效液相層析、電泳及離子交換柱層析進行分離純化 。 標記結合物的鑒定主要從標記結合比率、免疫活性、標記物活性等方面進行 。 Thank you !