標記物及其與抗原抗體的結(jié)合物制備(已修改)
2025-01-30 20:29 本頁面
【正文】 第一章 血液標本采集與處理 臨床免疫學(xué)檢驗技術(shù) 第四章 標記物及其與抗原抗體的結(jié)合物制備 汪 付 兵 /R20227 目 錄 第一節(jié) 標記物種類及特性 第二節(jié) 常見交聯(lián)劑的種類及特性 第三節(jié) 放射性核素與抗原抗體結(jié)合物制備 第四節(jié) 熒光素與抗原抗體結(jié)合物制備 第五節(jié) 酶與抗原抗體結(jié)合物制備 第六節(jié) 化學(xué)發(fā)光劑與抗原抗體的結(jié)合物制備 第七節(jié) 稀土離子與抗原抗體的結(jié)合物制備 第八節(jié) 量子點與抗原抗體的結(jié)合物制備 第九節(jié) 膠體金與抗原抗體的結(jié)合物制備 第一節(jié) 標記物的種類及特性 重點提示 放射性核素 熒光物質(zhì) 酶和酶作用底物 化學(xué)發(fā)光劑 量子點 膠體金 第一節(jié) 標記物的種類及特性 標記 免疫技術(shù) = 免疫技術(shù) + 標記技術(shù) 抗原抗體反應(yīng) 示蹤標記物 高特異性 高靈敏性 精密儀器檢測 高精密性 既可以與抗原或抗體相結(jié)合 ，又可以被相應(yīng)的儀器所檢測的物質(zhì) ， 這就是標記物 標記物在免疫分析中的作用在于示蹤標記并能夠被檢測 放射性核素 125I特點 化學(xué)性質(zhì)較活潑，標記方法簡單，容易獲取高比活性的標 記結(jié)合物； 衰變過程不產(chǎn)生電離輻射強的 β 射線，對標記多肽，蛋白抗原分子的免疫活性影響??； 衰變過程中釋放 γ 射線，可用 γ 計數(shù)器測量，方法簡便，易推廣應(yīng)用； 半衰期 (60天 )適中、核素豐度 (95％ )及計數(shù)率相對較高。 二、 熒光物質(zhì) 有機化合物熒光素 稀土離子螯合物 熒光底物（酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)） 熒光素 異硫氰酸熒光素（ fluorescein isothiocyanate, FITC） 四乙基羅丹明（ rhodamine, RB200） 四甲基異硫氰酸羅丹明（ tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC） 藻紅蛋白 (phycoerthrin, PE) 常用的熒光素特性 熒光物質(zhì) 最大吸收光譜 最大發(fā)射光譜 應(yīng)用 異硫氰酸熒光素 (FITC) 490～ 495nm 520～ 530nm （黃綠色） FAT、熒光偏振免疫測定 四乙基羅丹明 (RB200) 570～ 575nm 595～ 600nm（橙紅色） FITC的襯比染色或雙標記 FAT 四甲基異硫氰酸羅丹明 (TRITC) 550nm 620nm（橙紅色） FITC的襯比染色或雙標記 FAT 藻紅蛋白（ PE） 490560nm 595nm（紅色） 雙標記 FAT、流式細胞術(shù) 稀土離子 鑭系元素屬于三價稀土離子，包括銪（ Eu3+）、釤（Sm3+）、鋱 (Tb3+)、釹（ Nd3+）、鏑（ Dy3+）和鈰 (Ce3+)等。 銪是標記抗原抗體應(yīng)用最廣的元素 。 游離的稀土離子熒光比較弱，但與適當?shù)尿蟿┤?β 萘甲酰三氟丙酮（ β NTA）、三甲基乙酰三氟丙酮（ PTA）等形成螯合物后，可使熒光得到增強 。 稀土離子的 熒光特性 如下： 具有較大的 Stokes位移，發(fā)射光譜和激發(fā)光譜不會相互重疊。 熒光壽命長，熒光半衰期介于 101000μ s之間。 激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光譜帶很窄，甚至不到 10nm。 其他熒光物質(zhì) 某些化合物本身無熒光效應(yīng)，但經(jīng)酶催化后便具有強熒光 。 如 4甲基傘酮 β D半乳糖苷，受 β 半乳糖苷酶的作用后分解成 4甲基傘酮，可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為 360nm，發(fā)射光波長為 450nm。 其他如堿性磷酸酶的底物（ 4甲基傘酮磷酸鹽）和辣根過氧化物酶的底物（對羥基苯乙酸）等，都具有熒光底物的性質(zhì) 。 三、酶和酶作用底物 常用的酶標記物有 辣根過氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP) 堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) β 半乳糖苷酶 (β galactosidase, β Gal) 每種酶可與相應(yīng)的顯色或發(fā)光底物作用，產(chǎn)生典型的有色反應(yīng)物或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，通過反應(yīng)的顏色或發(fā)光強度對被檢物進行定性、定量分析 。 辣根過氧化物酶 HRP 辣根過氧化物酶（ HRP） 糖蛋白（主酶） 亞鐵血紅素（輔基） 主酶與酶活性無關(guān) 輔基是酶的活性中心 RZ值： 403nm （輔基） 與 275nm（主酶） OD值之比 RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比 RZ值更為重要 ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標記用酶 堿性磷酸酶 ALP及 β 半乳糖苷酶 堿性磷酸酶（ AP） 菌源性 AP 腸粘膜 AP β –半乳糖苷酶（ β Gal） 用于均相酶 免疫測定 HRP底物 HRP的底物 DH2+H2O2→ → → D+2H 2O HRP 供氫體 DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種 H2O2為受氫體， HRP對受氫體的專一性很高 HRP的常見底物 鄰苯二胺 OPD 四甲基聯(lián)苯胺 TMB 5氨基水楊酸 5ASA 2,2′ 氨基 二 (3乙基 苯并噻唑啉磺酸 6)銨鹽 ABTS 常用底物 OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長 492nm。不穩(wěn)定，致癌性。 TMB反應(yīng)后顯藍色 ，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色 ,測定波長450nm ，穩(wěn)定，無致癌性， ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。 HRP的常見底物 對羥基苯乙酸（ 4hydroxyphenylacetic acid， HPA） HPA具有熒光底物性質(zhì)，在 H2O2存在下被 HRP氧化成二聚體（熒光物質(zhì)），在 350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出 450nm波長的熒光 。 H2O2 HRP +熒 光 C O
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