【正文】 傘酮基 β D半 乳糖苷（ 4MUG ） 酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物 ，用熒光計(jì)測(cè)量。 四、化學(xué)發(fā)光劑 在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱(chēng)為 化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物 。 吖啶酯 在堿性條件下與 H2O2 就可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。 AE特性 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)簡(jiǎn)單，無(wú)需催化劑，背景噪聲低 。 發(fā)光過(guò)程快速， 1秒內(nèi)光子散射達(dá)高峰，整個(gè)過(guò)程在 2秒內(nèi)完成 。 特點(diǎn)：①反應(yīng)在電極進(jìn)行； ②電子供體為：三丙胺（ TPA） ③化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕 三聯(lián)毗啶釕 分子結(jié)構(gòu)圖 NNNN NNR uOONOO電化學(xué)發(fā)光劑 酶促反應(yīng)發(fā)光劑 酶促反應(yīng)發(fā)光劑： 是利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類(lèi)需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑稱(chēng)為酶促反應(yīng)發(fā)光劑。 由 IIVI族或 IIIV族元素組成，性質(zhì)穩(wěn)定，可接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光，具有類(lèi)似體相晶體的規(guī)整原子排布 。 量子點(diǎn)的光學(xué)特性 熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定性好，抗漂白能力強(qiáng) 所謂光漂白是指由光激發(fā)引起發(fā)光物質(zhì)分解而使熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。 具有 “ 調(diào)色 ” 功能，一元激發(fā)多元發(fā)射 不同粒徑的量子點(diǎn)具有不同的顏色，可用同一波長(zhǎng)的光激發(fā)不同大小的量子點(diǎn)，獲得多種標(biāo)記顏色 。 量子點(diǎn)調(diào)色功能 在紫外光激發(fā)下，相同組成不同粒徑的量子點(diǎn)的發(fā)射光譜 量子點(diǎn)的制備 大致分為兩種方法：物理制備法、化學(xué)合成法 。 化學(xué)合成法 有水相和有機(jī)相合成法 有機(jī)相體系 可制備性能優(yōu)良的量子點(diǎn)，如 CdSe及 CdSe/ZnS。 水相體系 操作簡(jiǎn)單、成本低廉、量子點(diǎn)表面形貌及性質(zhì)可控、易修飾各種基團(tuán) 。 無(wú)機(jī)殼層修飾法 合成核 /殼結(jié)構(gòu)的量子點(diǎn)，如在 CdSe量子點(diǎn)的外面包覆一層 CdS 或 ZnS 就構(gòu)成了以 CdSe為核，以 CdS 或 ZnS 為殼的量子點(diǎn)。 六、膠體金 膠體金（ colloidal gold） 也稱(chēng)金溶膠，是金鹽被還原成金原子后形成的金顆粒懸液 。 由于靜電作用，金顆粒之間相互排斥而懸浮成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，故稱(chēng)膠體金 。 膠體金顆粒大小不同，呈色不同，光吸收性也不同 最小的膠體金 (2nm～ 5nm)是橙黃色，中等大小膠體金(10nm～ 20nm)是酒紅色，較大顆粒膠體金 (30nm～ 80nm)則是紫紅色 。 常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、維生素 C、白磷、硼氫化鈉等 。 膠體金制備方法 常用的方法為檸檬酸三鈉還原法 以制備 16nm的膠體金為例，取 %的氯金酸水溶液100ml，加熱至沸騰，磁力攪動(dòng)下加入 1%的檸檬酸三鈉水溶液 2ml，淡黃色的氯金酸溶液很快變灰色，繼而黑色，隨后成酒紅色。 第二節(jié) 常用交聯(lián)劑及特性 重點(diǎn)提示 均一的雙功能交聯(lián)劑 非均一的雙功能交聯(lián)劑 交聯(lián)劑方法 交聯(lián)劑 生物大分子之間的偶聯(lián)，本質(zhì)上是生物大分子中活性基團(tuán)之間的連接 。 免疫標(biāo)記常用交聯(lián)劑 分子兩端各有一個(gè)相同或者不同的活性基團(tuán)，它們可與其它分子上的氨基、巰基、羥基等基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合而產(chǎn)生交聯(lián)作用 。 均一的雙功能交聯(lián)劑，其兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)相同 。 大分子抗原、抗體的標(biāo)記是利用雙功能交聯(lián)劑使標(biāo)記物與被標(biāo)記物結(jié)構(gòu)中的游離的氨基、羧基、硫氫基、咪唑基、酚基、羥基等基團(tuán)形成不可逆連接 。 有 CHO 、 N=C=O 、 N=C=S 、 SO2CH =CH2 等活潑雙鍵, 可與生物大分子中的 NH2 、 OH 、 SH 等進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。 碳二亞胺縮合法 碳二亞胺能激活蛋白質(zhì)分子上的羧基，反應(yīng)生成一個(gè)肽鍵（ CONH），經(jīng)碳二亞胺縮合反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中的游離羧基與標(biāo)記物分子中的氨基形成較穩(wěn)定的酰胺鍵 。 過(guò)碘酸鈉氧化法 利用過(guò)碘酸鹽氧化糖蛋白中糖基的鄰二羥基成為醛基，再通過(guò)醛基與標(biāo)記物分子中的伯氨基反應(yīng)形成schiff堿，后者經(jīng) NaBH4還原 — N＝ C— 鍵成為穩(wěn)定的結(jié)合物 。 非均一的雙功能交聯(lián)劑 N琥珀酰亞胺基 3(2吡啶基二硫 )丙酸醋 (SPDP)等屬于 非均一雙功能交聯(lián)劑 (heterobifunctional crosslinking reagent)。 SPDP分子結(jié)構(gòu)式 SPDP交聯(lián)原理 將蛋白質(zhì)（ P1NH2）通過(guò)酰胺化學(xué)反應(yīng)，引入二硫吡啶基（ DTP） 。 如果第二種蛋白質(zhì)分子（ P2）不含巰基，可按反應(yīng)（ 1）而得到 P2NHDTP，再與二巰基蘇糖醇（ DTT）起反應(yīng)，將 DTP基還原成巰基，所得 P2NHCOCH2CH2SH，再按反應(yīng)（ 2）方式交聯(lián)，制得結(jié)合物 II（ P1NHCOCH2CH2SSCH2CH2CONHP2） 。 交聯(lián)的程度容易測(cè)定，交聯(lián)后的大分子生物活性高于一般交聯(lián)劑方法 。 第三節(jié) 放射性核素與抗原抗體結(jié)合物的制備 重點(diǎn)提示 標(biāo)記物與抗原抗體結(jié)合物的制備基本方法 標(biāo)記物與抗原抗體結(jié)合物的純化 標(biāo)記物與抗原抗體結(jié)合物的鑒定 標(biāo)記物與抗原抗體結(jié)合物的保存 放射性核素與抗原抗體的結(jié)合物制備 一、 基本方法 氯胺 T(chT)法是常用的標(biāo)記方法，氯胺 T是一種氧化劑，它能使 125I+液中帶負(fù)電荷的碘離子氧化成帶正電荷的碘，然后取代抗原酪氨酸殘基芳香環(huán)上的氫 chT是對(duì)甲苯磺基酰胺的 N氯衍生物鈉鹽，在水中易分解成具氧化性的次氯酸：次氯酸可將 125I﹣ 氧化成帶正電荷的125I+，后者可取代抗原（或抗體）中酪氨酸殘基苯環(huán)上的氫原子，形成穩(wěn)定放射標(biāo)記物；最后加入還原劑偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）可終止反應(yīng) 125I結(jié)合物制備 直接標(biāo)記法 — 氯胺 T法 化學(xué)或酶促反應(yīng)，將放 射性負(fù)電碘離子氧化成 碘原子或正電碘離子， 通過(guò) 取代反應(yīng) 置換被標(biāo) 記物分子中 酪氨酸或酪 胺殘基以及組胺殘基上 的氫原子。 游離 125I和 125I標(biāo)記抗體（抗原）分子大小相差懸殊，采用凝膠層析即可分離，如葡聚糖凝膠