抗體的制備與應(yīng)用ppt課件-在線瀏覽
2025-05-09 06:09本頁(yè)面
【正文】 產(chǎn)生嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。其缺點(diǎn)限制了其在疾病診斷和治療中的應(yīng)用。這種雜交瘤細(xì)胞既具有骨髓細(xì)胞能大量無(wú)限增殖的特性，又具有 B細(xì)胞合成和分泌抗體的能力。 ? 制備流程： 免疫 — 融合 — 篩選 單克隆抗體制備流程 雜交瘤技術(shù)的原理 －小鼠骨髓瘤細(xì)胞： 不產(chǎn)生 Ig的重鏈和輕鏈；HGPRT。能永生化。不能永生化，但能分泌抗體， HGPRT+。 2. 細(xì)胞融合 骨髓瘤細(xì)胞 PEG 雜交瘤細(xì)胞 脾細(xì)胞 融合后細(xì)胞的類型 : 未融合的脾細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞 未融合的瘤細(xì)胞 ? 采用篩選培養(yǎng)基： HAT培養(yǎng)基 H次黃嘌呤、 A氨基喋呤、 T胸腺嘧啶 ? 只有融合成功的細(xì)胞（雜交瘤）才能在 HAT培養(yǎng)基上長(zhǎng)期生長(zhǎng)，原因在于只有雜交瘤能成功合成 DNA。 ? 外源性途徑（補(bǔ)救途徑） 利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在 HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）或 TK（胸腺嘧啶激酶）的催化作用下補(bǔ)救合成 DNA 融合后細(xì)胞在 HAT培養(yǎng)基中存活情況 脾細(xì)胞（ HGPRT+, TK+, 能生長(zhǎng)，但不能永生化） 骨髓瘤細(xì)胞（ HGPRT, TK，不能生長(zhǎng) ） 雜交瘤細(xì)胞（ HGPRT+, TK+ ，能生長(zhǎng)，且能永生化） 雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化 篩選： 免疫熒光 ELISA等 克隆化： 有限稀釋法 單個(gè)細(xì)胞顯微操作法 軟瓊脂培養(yǎng)法 配制方案： 雜交瘤細(xì)胞（（ 1～ 5） x106/ml) + 細(xì)胞凍存液(30%～ 40% 牛血清， 50%～ 60% RPMI1640培養(yǎng)液， 10%DMSO ) “慢凍 ” ： 分步冷凍， 30℃→ 70℃→ 液氮 “ 快融 ” ： 取出立即浸入 37℃ ～ 40℃ 水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇 5. 雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 6. 單克隆抗體的生產(chǎn) 體內(nèi)： BALB/c小鼠體內(nèi)誘發(fā)含有單抗的腹水 體外：無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)等 7. 單克隆抗體的純化 硫酸銨沉淀法 離子交換層析 A蛋白 Sepharose親和層析 單克隆抗體（ McAb）的優(yōu)缺點(diǎn) ? 優(yōu)點(diǎn)： ? 成分、結(jié)構(gòu)均一，特異性強(qiáng)。 ? 效價(jià)高 ? 使用一種抗原免疫動(dòng)物，可以獲得針對(duì)不同抗原決定基的不同特異性的 McAb。 ? McAb為鼠源性，應(yīng)用于人體將產(chǎn)生人抗鼠抗體（ Human antimouse antibody, HAMA） , 治療中可能引起過(guò)敏反應(yīng)且療效大大降低。 單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 （一）用作診斷試劑 ，區(qū)分不同分化 階段的淋巴細(xì)胞，鑒別淋巴細(xì)胞。 ，判 斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài) （二）用作研究工具 1. 純化抗原 2. 分析和探查抗原結(jié)構(gòu) 3. 分析抗原決定基的功能 （三）用于疾病的治療 1. 抗細(xì)胞表面分子單抗，用于移植排斥反應(yīng)的防治 2. 抗細(xì)胞因子單抗用于自身免疫性疾病的治療 3. 抗腫瘤單抗用于腫瘤的導(dǎo)向治療 單克隆抗體用于免疫治療存在的問題 1. 單克隆抗體的特異性 由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對(duì)腫瘤有嚴(yán)格特異性的單抗，對(duì)正常組織有交叉反應(yīng) 2. 異種抗體反應(yīng) 鼠源性單抗用于人體，導(dǎo)致超敏反應(yīng) 3. 生產(chǎn)成本高 ,技術(shù)要求高，穩(wěn)定性差，難于普及應(yīng)用 第三節(jié) 基因工程抗體的制備與應(yīng)用 (geic engineering antibody， GeAb) ? 概念：利用基因工程及蛋白工程技術(shù)，對(duì)抗體基因進(jìn)行改造，按人們需要重新組裝抗體或抗體基因片段，并轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后表達(dá)的規(guī)?；贵w。 基因工程抗體產(chǎn)生的時(shí)代背景 ? 單克隆抗體的毒副作用 ? 人雜交瘤技術(shù)未獲真正突破 :融合率低、建株難、不穩(wěn)定、產(chǎn)量低、人體不能隨意免疫 ? 現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的推動(dòng) ? 基因工程抗體的優(yōu)點(diǎn) ?基因工程抗體的優(yōu)點(diǎn)： ? 易于獲得稀有抗體 。 ? 小分子抗體：滲透力強(qiáng)、 HAMAR低、親和性高、靶向性高、組織非特結(jié)合少等。 原理 從鼠源的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分離并鑒定抗體 V區(qū)基因，再通
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