【正文】 心，獲得較純的沉淀。 13 2022/5/26 13 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)單、方便； 缺點(diǎn)： ①分離效果較差，費(fèi)時(shí)，不能一次得到純品； ②管壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別當(dāng)顆粒很大或濃度很高時(shí)，沉淀出現(xiàn)在離心管壁一側(cè)； ③顆粒被擠壓，離心力過(guò)大和離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，都會(huì)使顆粒變形、聚集而失活。 （三）等密度梯度離心 ? （ isopyic gradient centrifugation）適于分離大小相同而密度不同的物質(zhì)。 ? 高速離心和超速離心時(shí)，往往以相對(duì)離心力（ RCF）表示，如 60000 g等。即： rnFFR C Fgc ????? ? 16 2022/5/26 16 （二）離心時(shí)間 ?依據(jù)離心方法的不同 ， 離心時(shí)間的概念也有差別 。 ?離心時(shí)間時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，都會(huì)影響顆粒在離心管內(nèi)的預(yù)期位置，降低分離效果。 ? 離心速度較低或者物質(zhì)的耐熱性較好，也可以在室溫條件下進(jìn)行。 18 2022/5/26 18 （四） pH ? 離心介質(zhì)的 pH必須是處于待分離物質(zhì)穩(wěn)定的 pH范圍內(nèi)，必要時(shí)可用緩沖溶液。 19 2022/5/26 19 四、離心技術(shù)的應(yīng)用 ? 生物大分子的分離、濃縮和純化 20 2022/5/26 20 第二節(jié) 沉淀分離 ? 通過(guò)改變?nèi)芤旱臈l件或添加某種物質(zhì)，降低溶液中某一成分的溶解度，使其從溶液中沉淀析出，與其它成分分離的技術(shù)。 21 2022/5/26 21 一、鹽析法 ? 在物質(zhì)的水溶液中添加一定濃度的中性鹽，使物質(zhì)的溶解度減小而沉淀析出，這一過(guò)程稱為 “ 鹽析 ” 。 ? 缺點(diǎn)： 分離效果有限 22 2022/5/26 22 （一）鹽析的基本原理 ? 蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)親水基團(tuán)、與水形成水化膜的程度、以及所帶有電荷的情況決定的。同時(shí)，鹽離子所帶的電荷中和部分蛋白質(zhì)分子表面電荷，更加導(dǎo)致其溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。 ?但硫酸銨緩沖能力比較弱， pH難控制；銨離子干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。 24 2022/5/26 24 （三） 影響鹽析的因素 ? 1. 蛋白質(zhì)的濃度 過(guò)高過(guò)低都不好，一般認(rèn)為 %~%蛋白質(zhì)濃度比較合適。鹽析時(shí)溶液 pH常選擇接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，使蛋白質(zhì)的凈電荷接近零。但對(duì)溫度敏感的物質(zhì)，要求在 0 ℃ ~4 ℃ 進(jìn)行，防止蛋白質(zhì)變性。不同蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析所需要的離子強(qiáng)度不同 25 2022/5/26 25 （四）脫鹽 蛋白質(zhì)用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的方法有： ? 透析法 ? 超濾法 ? 葡聚糖凝膠 G50層析法。 ?有機(jī)溶劑破壞溶質(zhì)分子周圍的水化層；有機(jī)溶劑降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)的溶解度降低。 ?缺點(diǎn)： ①有機(jī)溶劑可使某些生物大分子變性失活，操作常需在低溫下進(jìn)行； ②有機(jī)溶劑具有一定毒性 28 2022/5/26 28 （二）有機(jī)溶劑的選擇 ?選擇有機(jī)溶劑的原則： ①有機(jī)溶劑的水溶性好； ②沉淀效率高； ③毒性小，避免損害工作人員的健康和污染環(huán)境； ④不與溶質(zhì)分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，價(jià)格便宜。 29 2022/5/26 29 ?殘留的有機(jī)溶劑去除的方法： ①自然蒸發(fā)或負(fù)壓蒸發(fā)，可在室溫進(jìn)行； ②凝膠過(guò)濾除去。 ? 2. 溫度： 實(shí)驗(yàn)要求在低溫條件下操作，有機(jī)溶劑需預(yù)冷至較低溫度。 ? 5. 離子濃度 ： 有機(jī)溶劑在中性鹽存在的條件下可以減少蛋白質(zhì)的變性，提高分離效率。 ? 6. 金屬離子： 一些多價(jià)陽(yáng)離子如 Zn2+、 Cu2+和 Ca2+ ，輔助沉淀 31 2022/5/26 31 三、非離子聚合物沉淀法 ?用聚乙二醇（ PEG）等非離子聚合物沉淀生物大分子。 ?廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸、酶、細(xì)菌和病毒的分離純化。 ?較麻煩的是 PEG 不易由蛋白質(zhì)沉淀中除去 ， 幸而 PEG 通常并不影響下一步純化步驟 32 2022/5/26 32 ?影響因素： ①樣品分子量： 樣品分子量越大，在一定 PEG濃度下的溶解度越低，越易被沉淀出來(lái)。一般低于 10 mg/ml為好。 ④離子強(qiáng)度： 低離子強(qiáng)度（ ）對(duì)沉淀影響不大，高離子強(qiáng)度（ ）則影響沉淀，使分段效果不明顯。但 PEG聚合度過(guò)高，溶液粘度過(guò)大，不易操作。 廣泛應(yīng)用于很多生命物質(zhì)的分析、制備和純化等。 36 2022/5/26 36 離子交換法的固定相是離子交換劑； 若擔(dān)體帶有正電荷，可吸附著負(fù)電荷分子，則為陰離子交換法；不帶凈電荷的分子，以及陽(yáng)離子則直接流出，不會(huì)被吸 附上去。它可分三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。 38 2022/5/26 38 離子交換層析對(duì)物質(zhì)的分離通常是在一根充填有離子交換劑的玻璃管（ cm 15 cm） 中進(jìn)行的。 ?任何離子通過(guò)柱時(shí)的移動(dòng)速率取決于與離子交換劑的親和力、電離程度和溶液中各種競(jìng)爭(zhēng)性離子的性質(zhì)和濃度。 ?大多數(shù)蛋白在生理 pH（ pH6～ 8）下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化 ，極端的 pH下蛋白會(huì)變性失活，應(yīng)盡量避免。改變 pH可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響， 一般采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。 41 2022/5/26 41 表 38 在陰離子交換柱上血漿蛋白組分的分段洗脫 NaCl(mol/L) IgG IgG IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原 轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原 α 2蛋白、白蛋白 IgA、 α 2蛋白、白蛋白 IgA、白蛋白 白蛋白 α 2蛋白、 β 脂蛋白、白蛋白 α 2蛋白、珠蛋白、白蛋白 α 2蛋白、 β 脂蛋白、珠蛋白、白蛋白 IgM、 β 脂蛋白、 β 球蛋白 銅藍(lán)蛋白、 β 蛋白 42 2022/5/26 42 三、技術(shù)要點(diǎn) （一）離子交換劑的選擇和處理 ? 兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定 pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。 ? 處理的目的：使交換劑充分溶脹，使其顆粒的孔隙增大，讓具有交換活性的電荷基團(tuán)充分暴露出來(lái)，再用酸堿浸泡，除去雜質(zhì)并使其帶上需要的反離子。 ? 溶液的離子強(qiáng)度常用不影響蛋白質(zhì)吸附到交換劑上的最高離子強(qiáng)度液，常用的離子強(qiáng)度為 20 mmol/L ~50 mmol/L NaCl。改變 pH可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。 （四）離子交換劑的再生與保存 ? 使其帶上所需的平衡離子。充分暴露電荷基團(tuán)增加有效交換容量； ?②離子強(qiáng)度： 溶液中離子強(qiáng)度增大時(shí)，離子對(duì)交換劑上的束縛位點(diǎn)就會(huì)增強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)作用，降低有效交換容量； ?③ pH： 弱酸型離子交換劑隨著 pH的增大，電荷基團(tuán)解離增加，交換容量加大。 帶有強(qiáng)電荷基團(tuán)的離子交換劑在任何 pH的溶液中都處于解離狀態(tài)，所以交換容量基本與 pH變化無(wú)關(guān)。 ? 該法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、重復(fù)性好、樣品回收率高，不需要有機(jī)溶劑、不改變樣品生物學(xué)活性 ， ? 除常用于分離純化蛋白質(zhì)、核酸、多糖、激素等物質(zhì)外，還可以用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，以及樣品的脫鹽和濃縮等。 一、基本原理 48 2022/5/26 48 （ 1）蛋白質(zhì)混合物上柱 。 （ 3）小分子被滯留，大分子向下移動(dòng)，大小分子開(kāi)始分開(kāi) 。 （ 5）大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在行進(jìn)中。 ?凝膠層析中物質(zhì)的分子量不是唯一的分離依據(jù)，有些物質(zhì)的分子量相同，但由于分子的形狀不同，再加上各種物質(zhì)與凝膠之間存在著非特異性的吸附作用，故仍然可分開(kāi)。常