【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 2蛋白、白蛋白 IgA、 α 2蛋白、白蛋白 IgA、白蛋白 白蛋白 α 2蛋白、 β 脂蛋白、白蛋白 α 2蛋白、珠蛋白、白蛋白 α 2蛋白、 β 脂蛋白、珠蛋白、白蛋白 IgM、 β 脂蛋白、 β 球蛋白 銅藍(lán)蛋白、 β 蛋白 42 2022/5/26 42 三、技術(shù)要點(diǎn) （一）離子交換劑的選擇和處理 ? 兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定 pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。 ? 大多數(shù)蛋白在生理 pH（ pH6～ 8）下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的 pH下蛋白會(huì)變性失活，應(yīng)盡量避免。 ? 處理的目的：使交換劑充分溶脹，使其顆粒的孔隙增大，讓具有交換活性的電荷基團(tuán)充分暴露出來(lái)，再用酸堿浸泡，除去雜質(zhì)并使其帶上需要的反離子。 （二）裝柱和加樣 ? 選擇平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和 pH時(shí)，首先要保證待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；其次是使離子交換劑與待分離物質(zhì)有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，而不與樣品中雜質(zhì)結(jié)合，以達(dá)到分離的目的。 ? 溶液的離子強(qiáng)度常用不影響蛋白質(zhì)吸附到交換劑上的最高離子強(qiáng)度液，常用的離子強(qiáng)度為 20 mmol/L ~50 mmol/L NaCl。 （三）洗脫和收集 ? 洗脫可采用改變?nèi)芤旱?pH或離子強(qiáng)度，也可同時(shí)改變 pH與離子強(qiáng)度的方法。改變 pH可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。 ? 用一定鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來(lái)。 （四）離子交換劑的再生與保存 ? 使其帶上所需的平衡離子。 43 2022/5/26 43 二、常用的離子交換劑種類和性質(zhì) ?疏水性離子交換劑 ? 是一種人工合成的、與水結(jié)合力較小的樹(shù)脂 ? 陽(yáng)離子交換劑、陰離子交換劑（包括強(qiáng)、中、弱三種離子交換基團(tuán)） ?親水性離子交換劑 ? 纖維素離子交換劑 ? 交聯(lián)葡聚糖離子交換劑 ? 瓊脂糖離子交換劑 ? 陽(yáng)離子交換劑、陰離子交換劑（包括強(qiáng)、中、弱三種離子交換基團(tuán)） 44 2022/5/26 44 四、影響交換容量的因素 ?① 離子交換劑顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及分離的樣品組分的質(zhì)量大小： 一般離子交換劑的孔隙應(yīng)盡量讓樣品組分進(jìn)入，使樣品組分與離子交換劑作用面積增大。充分暴露電荷基團(tuán)增加有效交換容量； ?②離子強(qiáng)度： 溶液中離子強(qiáng)度增大時(shí)，離子對(duì)交換劑上的束縛位點(diǎn)就會(huì)增強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)作用，降低有效交換容量； ?③ pH： 弱酸型離子交換劑隨著 pH的增大，電荷基團(tuán)解離增加，交換容量加大。但弱堿型離子交換劑的交換容量隨著 pH的下降而增大。 帶有強(qiáng)電荷基團(tuán)的離子交換劑在任何 pH的溶液中都處于解離狀態(tài)，所以交換容量基本與 pH變化無(wú)關(guān)。 45 2022/5/26 45 第四節(jié) 凝膠層析（ gel chromatography） 凝膠排阻層析（ gel exclusion chromatography） 分子篩層析（ molecular sieve chromatography） ? 是以各種多孔凝膠為固定相，當(dāng)混合物隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)凝膠層析柱時(shí)，其中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。 ? 該法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、重復(fù)性好、樣品回收率高，不需要有機(jī)溶劑、不改變樣品生物學(xué)活性 ， ? 除常用于分離純化蛋白質(zhì)、核酸、多糖、激素等物質(zhì)外，還可以用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，以及樣品的脫鹽和濃縮等。 46 2022/5/26 46 47 2022/5/26 47 凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多空網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、呈珠狀顆粒的物質(zhì)，每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，像篩子，小的分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而大的分子則排阻于顆粒之外。 一、基本原理 48 2022/5/26 48 （ 1）蛋白質(zhì)混合物上柱 。 （ 2）洗脫開(kāi)始，小分子擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，大分子則被排阻于顆粒之外 。 （ 3）小分子被滯留，大分子向下移動(dòng)，大小分子開(kāi)始分開(kāi) 。 （ 4）大小分子完全分開(kāi) 。 （ 5）大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在行進(jìn)中。 49 2022/5/26 49 ?如果兩種以上不同相對(duì)分子質(zhì)量的分子都能進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔，但由于它們被排阻和擴(kuò)散的程度不同，在凝膠柱中所經(jīng)過(guò)的路程和時(shí)間也不同，從而彼此也可以分離開(kāi)來(lái)。 ?凝膠層析中物質(zhì)的分子量不是唯一的分離依據(jù)，有些物質(zhì)的分子量相同，但由于分子的形狀不同，再加上各種物質(zhì)與凝膠之間存在著非特異性的吸附作用，故仍然可分開(kāi)。 50 2022/5/26 50 二、常用凝膠 ?凝膠是一類不溶于水，在水中有較大膨脹度和較好分子篩功能的化合物。常用的有： ? 葡聚糖凝膠（ dextran） ? 聚丙烯酰胺凝膠（ polyacrylamide） ? 瓊脂糖凝膠（ agarose） ? 聚丙烯酰胺和瓊脂糖交聯(lián)凝膠 ? 另外還有多孔玻璃珠、多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等。 51 2022/5/26 51 52 2022/5/26 52 第五節(jié) 親和層析法 ? 親和層析是利用某些生物分子之間專一可逆結(jié)合特性的一種高度專一的吸附層析類型。 ? 配體是發(fā)生親和反應(yīng)的功能部位，也是載體和被親和分子之間的橋梁。 ? 配體本身必須有兩個(gè)基團(tuán)： 一個(gè)能與載體共價(jià)結(jié)合，連接后的配體對(duì)互補(bǔ)分子的親和力不會(huì)改變 一個(gè)能與被親和分子結(jié)合。 53 2022/5/26 53 親和層析法有點(diǎn)像在釣魚(yú)，魚(yú)是我們所要的分子 (B) 雜夾在一堆蛋白質(zhì)當(dāng)中，魚(yú)餌是與 B 具有專一性的分子 (A, 上圖 1)； A 與 B 的專一性很高，只會(huì)在樣本中與 B 結(jié)合，而排除其它雜質(zhì) (上圖 2)；若把結(jié)合在吸著劑上的 B 溶離下來(lái)，就可以得到均質(zhì)的 B (上圖 3)。 54 2022/5/26 54 55 2022/5/26 55 二、載體和配體的選擇 （一） 載體 理想的載體應(yīng)具備以下特性： ，使固相配體易與水溶液中的生物大分子物質(zhì)接近。 ，非特異吸附性極低。 ，而且容易和配體結(jié)合，不改變載體和配體的基本性質(zhì)。 ，不易受到周圍條件（如 pH、離子強(qiáng)度、溫度、變性劑和去污劑等）的影響。機(jī)械性能好，具有一定的顆粒形式以保持一定的流速。 ，能使被親和的大分子自由通過(guò)而增加配體的有效濃度。 常用的載體有纖維素、 瓊脂糖凝膠 、交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和多孔玻璃等。 56 2022/5/26 56 （二） 配體 優(yōu)良的配體須具備以下特性： 1. 配體與待分離的物質(zhì)有 適當(dāng)?shù)挠H和力 。 2. 配體與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有 較強(qiáng)的特異性 ，不與其它組分有非特異性吸附作用。 3. 配體必須 具備與載體共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán) ，而且這種結(jié)合不能嚴(yán)重影響配體間的親合力及結(jié)合特異性。 4. 配體應(yīng)具有 較好的穩(wěn)定性 ，能夠耐受偶聯(lián)以及洗脫時(shí)可能的較劇烈的條件，可以多次重復(fù)使用。 57 2022/5/26 57 表 316 親和層析中部分蛋白配體 配基 純化的物質(zhì) 蛋白 A/蛋白 B 各種免疫球蛋白 單克隆抗體 各種抗原、蛋白 A 抗原 特異性單克隆抗體、特異性多克隆抗體 核苷酸 核苷酸結(jié)合蛋白、核苷酸酶 血凝素 糖蛋白 蛋白酶抑制劑 蛋白酶 脂肪酸 脂肪酸結(jié)合蛋白、清蛋白 糖 血凝素、糖 苷 甘酶 生物素 親和素、生物素結(jié)合蛋白 肝素 凝血因子、酯酶、 DNA聚合酶、連接組織蛋白酶 鈣調(diào)蛋白 鈣調(diào)蛋白結(jié)合酶 Triazine染料 脫氫酶、激酶、多聚酶、干擾素、限止酶等 58 2022/5/26 58